Сучасні підходи до лікування остеоартрозу з позицій доказової медицини: роль глюкозаміну сульфату

Остеоартроз (ОА) є значною медичною проблемою через високу й усе зростаючу поширеність у популяції, повільне, але неухильне прогресування клінічних і рентгенологічних проявів хвороби з поступовим зниженням якості життя пацієнтів аж до інвалідності.

Остеоартроз (ОА) є значною медичною проблемою через високу й усе зростаючу поширеність у популяції, повільне, але неухильне прогресування клінічних і рентгенологічних проявів хвороби з поступовим зниженням якості життя пацієнтів аж до інвалідності. Зважаючи на постаріння населення України, значну урбанізацію, розвиток транспортних засобів, що призвело до зменшення фізичного навантаження та збільшення маси тіла, поширеність ОА зростатиме й надалі [3, 5].

Перші обґрунтовані рекомендації відносно фармакотерапії ОА були опубліковані Американським інститутом ревматології у 1995 р. З того часу цей документ зазнав значних змін, однак стратегія лікування залишилася незмінною. Отже, метою фармакотерапії ОА була й залишається ліквідація болю, збереження й покращання функції суглобів, боротьба з прогресуванням захворювання та функціональних порушень.

В останніх рекомендаціях EULAR (2003) [13] усі засоби для лікування ОА колінних суглобів діляться на швидкодіючі та повільнодіючі препарати симптоматичної дії (symptoms modifying antiosteoarthritis drugs – SMOADs).

Симптоматичні засоби швидкої дії (нестероїдні протизапальні препарати (НПЗП), наркотичні анальгетики, глюкокортикоїди тощо) впливають на симптоми захворювання – біль і запалення. Однак було продемонстровано, що деякі НПЗП, які найчастіше використовуються як симптоматичні засоби в лікуванні ОА, негативно впливають на його перебіг [20, 22]. Навіть найновіші й, можливо, безпечніші НПЗП – селективні блокатори ЦОГ-2 – не покращують тривалого перебігу захворювання щодо структурних змін у суглобах порівняно з традиційними НПЗП. З огляду на це значна увага приділяється більш специфічним сполукам, які можуть вплинути на певні механізми, що лежать в основі ОА, і сприяти сповільненню прогресування недуги й зниженню інвалідності пацієнтів у віддаленій перспективі.

Препарати для терапії ОА, здатні модифікувати перебіг захворювання, належать до окремої групи – SYSADOA: глюкозаміну сульфат, хондроїтин сульфат, діацерин і гіалуронова кислота. Слід зазначати, що серед цих препаратів лише перші два мають рівень доказовості А.

Хондропротектори

Ефект засобів сповільненої дії, що модифікують перебіг захворювання, проявляється досить повільно, але й утримується триваліший час після їх відміни, до того ж вони здатні зупинити структурні зміни суглобового хряща й прогресування ОА, а отже, на значний термін відстрочити проведення таких маргінальних хірургічних втручань, як тотальне ендопротезування суглобів.

Прогрес у вивченні патогенезу ОА дав змогу сформулювати концепцію хворобомодифікуючої терапії, спрямованої як на зменшення основних симптомів ОА – болю і запалення, так і на структурну модифікацію, тобто відновлення суглобового хряща.

Вимоги до структурно-модифікуючих препаратів (хондропротекторів) [29]:

• докази лікувального ефекту (симптоматичного та структурно-модифікуючого) й безпечності (рандомізовані плацебо контрольовані подвійні сліпі дослідження тривалістю не менше 3 років);
• пріоритет у виборі діючої речовини на основі біохімічних закономірностей в організмі;
• оптимальність фармакокінетичних параметрів (повноцінне всмоктування, високий ступінь розподілу в тканинах суглоба, тропність тощо);
• якість фармацевтичного виробництва (стандартизація, стабілізація, регульована швидкість вивільнення діючої речовини);
• сучасність лікарських форм і кратність прийому;
• переваги курсового лікування порівняно з іншими методами терапії при фармакоекономічному аналізі.

Першим клінічно випробуваним препаратом, що модифікує перебіг ОА і відповідає сучасним вимогам, є глюкозаміну сульфат.

Глюкозамін – фундаментальний будівельний матеріал, необхідний для синтезу глікопептидів, глікозаміногліканів, глікопротеїнів, протеогліканів, гіалуронової кислоти. Безпосередньо чи опосередковано він відіграє роль у формуванні суглобових поверхонь, сухожиль, зв'язкового апарату, синовіальної рідини, кісткової тканини. Отже, глюкозамін бере участь у синтезі сполучної тканини і завдяки цьому може сприяти гальмуванню процесів руйнування суглобового хряща та стимулюванню його регенерації, що й зумовило його використання в лікуванні ОА.

Глюкозамін синтезується хондроцитами з глюкози в присутності глютаміну й використовується для продукції глікозаміногліканів і протеогліканів. Дослідження довели, що переважно екзогенний глюкозамін бере участь у синтезі протеогліканів хондроцитами [6].

Останнім часом увагу науковців привернули глюкозаміну сульфат та хондроїтин сульфат для лікування ОА, оскільки в низці рандомізованих клінічних досліджень були продемонстровані симптоматичні й структурно-модифікуючі (для глюкозаміну сульфату) ефекти цих препаратів. Більшість досліджень відносно ефективності глюкозаміну проводилася з використанням його сульфатованої форми виробництва компанії Rottapharm.

Питання про роль сульфатів у патогенезі ОА широко обговорюється в літературі. Було доведено, що хондроцити людини надзвичайно чутливі до навіть незначного зниження вмісту сульфату [27], а в разі нестачі сульфату in vitro порушується синтез глікозаміногліканів [28]. Сульфатні залишки беруть участь у синтезі глікозаміногліканів і метаболізмі хрящової тканини, а сульфатні ефіри бокових ланцюгів у складі протеогліканів мають суттєве значення для підтримання еластичності й здатності утримувати воду матриксом хряща.

На сьогодні існують три основні солі глюкозаміну: глюкозаміну сульфат, глюкозаміну гідрохлорид і N-ацетилглюкозамін. Відповідно, різні препарати містять різні солі глюкозаміну. У європейських країнах більше розповсюдження отримав глюкозаміну сульфат, а в США переважають препарати (біологічно активні добавки) на основі глюкозаміну гідрохлориду.

Дослідження ефективності глюкозаміну

Ефективність і безпечність глюкозаміну сульфату вивчалася в кількох рандомізованих контрольованих дослідженнях у хворих на ОА із ураженням колінних суглобів. Проблема відмінностей в ефективності різних солей глюкозаміну виглядає вельми актуальною через те, що база даних, яка відповідає вимогам доказової медицини, існує лише для глюкозаміну сульфату. В усіх рандомізованих клінічних випробуваннях використовувався оригінальний кристалічний глюкозаміну сульфат компанії Rottapharm. В Україні цей препарат зареєстровано під назвою «Дона». Наразі складно поширити результати досліджень, проведених із використанням оригінального глюкозаміну сульфату, на різноманітні та іноді неконтрольовані рецептури інших харчових добавок, що, як стверджується в їх анотаціях, містять глюкозамін [18].

Клінічну ефективність глюкозаміну сульфату було детально вивчено в численних нетривалих дослідженнях, результати яких лягли в основу метааналізів, опублікованих T.E. McAlindon і T.E. Towheed [16, 24, 26]. Симптоматичну дію глюкозаміну сульфату підтверджено у понад 6 тис. хворих із ОА різної локалізації (колінні, кульшові, плечові, дрібні суглоби кистей, хребет) при аналізі 20 опублікованих досліджень (з 1966 до 1999 рр.). Автори дійшли висновку, що глюкозаміну сульфат дійсно впливає на симптоми ОА, при цьому сила цього ефекту коливається від помірної до високої, також відзначається добра переносимість препарату.

Більш точний і детальний метааналіз, що охоплює 16 рандомізованих досліджень, було опубліковано на початку 2001 р. у вигляді Кохранівського огляду [24], в якому було підтверджено високий ступінь безпечності глюкозаміну сульфату, а також його ефективність. У третьому систематичному огляді, опублікованому в 2005 р. також у вигляді Кохранівського огляду, проведено порівняння ефективності застосування різних глюкозамінів у хворих на ОА [25]. Було зроблено висновок, що дія різних препаратів глюкозаміну суттєво відрізняється.

Найкращі результати отримано при використанні глюкозаміну сульфату компанії Rottapharm. Саме цей препарат впливає на структурні зміни, а відтак, і на перебіг ОА. Оригінальний глюкозаміну сульфат проявляє подібний або навіть більш виражений симптоматичний ефект, ніж НПЗП, щодо короткочасного контролю симптомів [5], до того ж його безпечність не викликає сумнівів. У згаданому систематичному огляді наголошується про відсутність даних щодо такої ж ефективності глюкозаміну гідрохлориду.

Не викликає сумнівів, що препарати з «однаковою» діючою речовиною можуть проявляти різні ефекти і суттєво відрізнятися за дієвістю, оскільки містять різні солі, розчинники, переважаючі ізомери, різняться за чистотою і вмістом домішок тощо. Це все позначається на фармакокінетичних і фармакодинамічних властивостях препарату, а отже, й на клінічній дієвості засобу.

На особливу увагу заслуговують два тривалих рандомізованих клінічних дослідження, присвячених впливу глюкозаміну сульфату (препарат Дона фармацевтичної фірми Rottapharm), на прогресування симптомів і змін структури колінного суглоба при ОА. Особливістю цих досліджень є те, що в цілому спостереження за хворими (подвійне сліпе плацебо контрольоване) проводилося протягом 5 років.

У дослідженні J.Y. Reginster et al. дієвість безперервного застосування глюкозаміну сульфату 1500 мг раз на день було апробовано у 212 пацієнтів віком за 45 років із ОА колінних суглобів. Тривалий прийом глюкозаміну сульфату зумовив покращання стану пацієнтів, зниження інтенсивності больового синдрому за візуально-аналоговою шкалою (індекс WOMAC), а також зупиняв структурні зміни суглобового хряща й прогресування ОА. Подальше спостереження за пацієнтами, які приймали глюкозаміну сульфат, засвідчило, що застосування цього препарату вдвічі знижувало потребу в операціях на суглобах нижніх кінцівок, у т. ч. ендопротезування. Суттєво зменшувалися й витрати на лікування.

Друге тривале рандомізоване дослідження підтвердило статус глюкозаміну сульфату (препарат Дона) як засобу, здатного модифікувати перебіг ОА [18]. Глюкозаміну сульфат у дозі 1500 мг/добу вірогідно зупиняв прогресування ОА вже на першому році терапії; цей ефект утримувався до завершення 3-річного курсу лікування. Суттєві відмінності порівняно з групою плацебо спостерігалися під час аналізу ширини суглобової щілини. У групі пацієнтів, які отримували плацебо, суглобова щілина прогресивно звужувалася, що вказує на неухильне прогресування захворювання (рис). Через 3 роки лікування кількість пацієнтів із високою частотою діагностики остеофітів у групі плацебо була втричі вищою, ніж при застосуванні глюкозаміну сульфату.

Оцінивши структурно-модифікуючий ефект препарату глюкозаміну сульфат, автори вирішили продовжити дослідження з метою оцінки ризику появи потреби в тотальному ендопротезуванні суглобів у цих хворих [17]. Результати виявилися приголомшливими: зниження відносного ризику ендопротезування суглобів через 5 років після закінчення прийому глюкозаміну сульфату становило 73% (табл. 1). Отже, на сьогодні Дона – єдиний структурно-модифікуючий препарат при ОА, для якого доведено зниження необхідності тотального ендопротезування суглобів нижніх кінцівок при тривалому прийомі.

Здавалося б, препарати з однаковою діючою речовиною повинні мати однакову дію та ефективність, тобто бути клінічно еквівалентними, але насправді це не так.

Дослідження GAIT і GUIDE

Нещодавно завершився перший етап масштабного американського дослідження GAIT (Glucosamine/Chondroitin Arthritis Intervention Trial) під егідою Національного центру додаткової та альтернативної медицини (NCCAM) і Національного інституту артритів, м'язово-скелетних і шкірних захворювань (NIAMS). Це рандомізоване клінічне дослідження, розпочате в 2000 р., мало на меті порівняти нетривалу (6-місячну) симптоматичну ефективність глюкозаміну, хондроїтин сульфату та їх комбінації з плацебо, а також з'ясувати, чи комбінація хондроїтин сульфату із глюкозаміном ефективніша за монотерапію.

На наступному етапі планується опублікувати отримані результати досліджень відносно структурно-модифікуючих ефектів цих речовин. У 16 академічних центрах було відібрано 1583 пацієнти, завершили дослідження 1258 (80%). Хворих було розділено на 5 груп відповідно до завдань дослідження. Потрібно зауважити, що в дослідженні використовували глюкозаміну гідрохлорид як найпоширенішу сіль глюкозаміну на американському континенті, що входить до складу багатьох біологічно активних добавок, які пропонуються для лікування ОА. Пацієнти І групи отримували глюкозаміну гідрохлорид 1500 мг/день; ІІ – 1200 мг/день хондроїтин сульфат; ІІІ – комбінацію цих речовин; IV – целекоксиб 200 мг/добу; V – плацебо.

Отримані результати здивували, частково розчарували, зумовили дискусію науковців, порушили нові проблемні питання. Загалом не вдалося отримати очікуваних визначених висновків у доказовості ефективності глюкозаміну гідрохлориду й комбінації глюкозаміну з хондроїтин сульфатом.

Насамперед привернула увагу значна кількість пацієнтів, які відповіли на плацебо. На цьому тлі ефект препаратів виглядає непереконливим і не досить вираженим. Висока ефективність була притаманна целекоксибу: різниця в частках хворих, які відповіли на плацебо і целекоксиб, становить 10%. Застосування глюкозаміну, хондроїтин сульфату і їх комбінації супроводжувалося більшою частотою відповідей на лікування порівняно з плацебо, проте різниця становила лише 4-6%. Статистично значущої різниці між групами плацебо й комбінованої терапії було досягнуто лише при високому рівні больового синдрому. Можливо, це пов'язано з тим, що при високому рівні болю легше продемонструвати ефективність препаратів, ніж за мінімальних значень шкали. Цей факт підтвердив гетерогенність хворих на ОА: пацієнти з низьким рівнем болю – це патогенетично інша група, що якісно відрізняється від пацієнтів із високим рівнем больових відчуттів. Імовірно, більш жорсткий відбір пацієнтів до дослідження дав би змогу уникнути цих проблем.

На презентації результатів дослідження її модератор професор Клег (D.O. Clegg) зазначив, що загалом не отримано доказів ефективності комплексу глюкозаміну гідрохлориду/хондроїтин сульфату порівняно з плацебо. Проте, незважаючи на проблемні результати першого етапу дослідження GAIT, уся медична спільнота з нетерпінням чекає на результати другої її частини – оцінку структурно-модифікуючих ефектів глюкозаміну та хондроїтину при ОА колінних суглобів.

На щорічній конференції Американської колегії ревматологів (ACR), що відбулась у листопаді 2005 р. у Сан-Дієго (Каліфорнія), були репрезентовані результати іншого рандомізованого багатоцентрового подвійного сліпого клінічного дослідження – GUIDE, проведеного в Іспанії та Португалії. У дослідженні використовувався оригінальний глюкозаміну сульфат 1500 мг один раз на день. Метою дослідження була оцінка симптоматичного ефекту оригінального кристалічного глюкозаміну сульфату виробництва Rottapharm у дозі 1500 мг/день протягом 6 місяців. Його ефективність і вплив на біль оцінювалися порівняно з групами пацієнтів, які приймали парацетамол 1000 мг тричі на день і плацебо. Отримані результати підтвердили високу симптоматичну активність глюкозаміну сульфату. Так, відсоток пацієнтів, які відповіли на плацебо, становив розумну величину – 21,2%; на лікування оригінальним глюкозаміном сульфатом відповіли 39,6%; на лікування парацетамолом – 33,3%. Глюкозаміну сульфат виявився ефективнішим за плацебо за всіма параметрами. Для парацетамолу частка пацієнтів, які відповіли на лікування, була вищою, ніж у групі плацебо, але статистично значущого покращання за індексами Лекена і WOMAC досягнуто не було. Крім того, у групі плацебо вірогідно більша частка пацієнтів використовувала екстрену аналгезію порівняно з групою хворих, які приймали глюкозамін [11].

Порівнюючи результати двох досліджень – GAIT і GUIDE – слід наголосити на істотній різниці у відповіді на використання глюкозаміну порівняно з плацебо (табл. 2). Різниці серед пацієнтів, які відповіли на лікування парацетамолом (дослідження GUIDE) чи целекоксибом (дослідження GAIT) відносно плацебо, становлять 10 і 12% і є статистично значущими в обох випадках. А ось різниці у частці хворих, які відповіли на глюкозаміну гідрохлорид щодо плацебо, становить усього 4% (GAIT) порівняно з різницею у 18,4% пацієнтів, які відповіли на лікування глюкозаміну сульфатом (GUIDE).

У цілому результати дослідження GUIDE засвідчують, що глюкозаміну сульфат є дієвим засобом лікування ОА колінних суглобів.

Глюкозаміну сульфат – перший фармакологічний засіб, що уповільнює прогресування ОА при тривалому лікуванні відповідно до сучасних наукових рекомендацій. Ця сполука заслуговує на увагу як засіб, що модифікує перебіг недуги при лікуванні ОА. Європейська протиревматична ліга (EULAR) у 2003 р. установила рівень доказовості глюкозаміну сульфату 1А при гонартрозі, а в 2004 р. підтвердила ефективність терапії для ОА будь-якої локалізації [13].

Розпочинаючи лікування остеоартрозу й обираючи структурно-модифікуючий препарат для тривалої терапії, на нашу думку, слід керуватися принципом, сформульованим G.H. Guyatt: «У лікарській практиці необхідно знаходити методи і препарати з найвищим ступенем доказовості ефекту, інтегрувати їх із власним клінічним досвідом і поглядами та рухатися від доказів до дій» [10].

Список літератури:

1. Глюкозамина гидрохлорид и хондроитина сульфат в лечении остеоартроза коленных суставов: данные доказательной медицины (исследование GAIT) // Український ревматологічний журнал. – 2006.- № 1(23).- С. 47-48.
2. Голубев Г., Кригштейн О. Молекулярная патология остеоартроза как основа создания патогенетически обоснованной структурно-модифицирующей терапии // Междунар. журнал мед. практики. – 2005.- № 2.- С. 30-37.
3. Насонов Е.Л. Современные наспрвления фармакотерапии остеоартроза // Consilium medicum.- 2001.- №12.- С. 509-514.
4. Нейко Є.М., Головач І.Ю. Сучасні уявлення про патогенез деформуючого остеоартрозу // Український ревма­тологічний журнал.- 2000.- Т.1, № 1. - С. 9-12
5. Цветкова Е.С., Панасюк Е.Ю., Иониченок Н.Г. Глюкозамин сульфат (Дона) в терапии гонартроза: возможности и перспективы // Научно-практическая ревматология. – 2004.- №2.- С. 34-37.
6. Bassleer C., Rovati L., Franchimont P. Stimulation of proteoglican production by glucosamine sulfate in chondrocytes isolated from human osteoarthritic articular cartilage in vitro // Osteoarthr. Cartil. – 1998.- Vol. 6.- P. 427-434.
7. Clegg D.O. Glucosamine, Chondroitin Sulfate and Two in Combination for Painful Knee Osteoarthritis // N.Engl.J.Med.- 2006.- Vol. 354.- P. 795-808.
8. Dodge G.R., Jimenez S.A. Glucozamine sulfate modulates the level of aggrecan and matrix metalloproteinase-3 synthesized by cultured human osteoarthritis articular chondrocytes // Osteoarthritis Cartilage.- 2003.- Vol. 11.- P. 424-432.
9. Forchammer L., Thorn M., Met Y.O., et al. Immunobiological effects of glucosamine in vitro // Scand. J. Immunol.- 2003.- Vol. 58.- P.404-411.
10. Guyatt G.H. Evidence-based management of patients with osteoporosis // J.Clin.Densitometry.- 1998.- Vol. 1.- P. 395-402.
11. Herrero-Beaumont G., Roman J.A., Trabado M.C. Effects of glucosamine sulfate on 6-month control of knee osteoarthritis symptoms vs placebo and acetaminophen: results from the Glucosamine Unum in Die Efficacy (GUIDE) Trial // "Arthritis Rheum 2006; in press".
12. Hua J., Sakamoto K., Nagaoka I. Inhibitory actions of glucosamine, a therapeutic agent for osteoarthritis, on the functions of neutrophils // J.Leukos.Biol.- 2002.- Vol. 71.-P. 632-640.
13. Jordan K.M., Arden N.K., Doherty M., et al. EULAR Recommendations 2003: an evidence based approach to the management of knee osteoarthritis: Report of a Task Force of the Standing Committee for International Clinical Studies Including Therapeutic Trials (ESCISIT) // Ann. Rheum. Dis.- 2003.- Vol.62, №12.- Р.1145-1155
14. Largo R., Alvarez-Soria M.A., Diez-Ortego I., et.al. Glucosamine inhibits IL-1 beta-induced NFkappab activation in human osteoarthritis chondrocytes // Osteoarthritis Cartilage.- 2003.- Vol. 11.- P. 290-298.
15. Ma L., Rudent W.A., Harnaha J., et al. Immunosupresive effects of glucosamine // J.Biol.Chem.- 2002.- Vol. 227.- P. 39343-39349.
16. McAlindon T.E., La Valley M.P., Gulin J.P., et al. Glucosamin and chondroitin for the treatment of osteosrthritis. A systemaic qualify assessment and meta-analysis //JAMA.- 2001.- Vol. 357.- P. 247-248.
17. Pavelka K., Gatterova J., Giacovelli G., et al. Glucosamin sulphate prevent total joint replacement in the long-term follow-up of knee osteoarthritis patients // Arthritis Rheum.- 2004.- Vol. 49, Suppl.- A251.
18. Pavelka K., Gatterova J., Olejarova M., et al. Glucosamin sulfate use and delay of progression of knee osteoarthritis: a 3-year, a randomized, placebo-controlled, double-blind study // Arch. Intern. Med.- 2002.- Vol.162.- P.2113-2123.
19. Piepoli T, Zanelli T, Letari O, Persiani S, Rovati LC, Caselli G. Glucosamine sulfate inhibits IL-1b-stimulated gene expression at concentrations found in humans after oral intake [abstract]. Arthritis Rheum 2005, 9 Suppl:1326.
20. Rashad S., Revell P., Hemmingwey A., et al. Action of nonsteroidal antiinflammatory drugs on current of osteoarthritis // Lancet.- 1989.- Vol. 2.- P. 519-522.
21. Reginster J.Y., Deroisy R., Rovali L.C., et al. Long-term effects of glucosamine sulphate on osteoarthritis progression: a randomized, placebo-controlled clinical trial // Lancet.- 2001.- Vol. 357 (9252).- P. 251-256.
22. Reijman M., Bierma-Zeinstra S.M., Pols H.A., et al. Is there an association between the use of different types of nonsteroidal antiinflammatory drugs and radiologic progression of osteoarthritis?// Arthritis Rheum.-2005.- Vol. 52.- P. 3137-3142.
23. Shikhman A.R., Kuhn K., Alaaeddine N., Lotz m. N-acetylglucosamine prevent IL-1b-mediated activation of human chondrocytes // J.Immunol.- 2001.- Vol.166.- P. 5155-5160.
24. Towheed T.E. Maxwell L., AnastassiadesT.P., et al. Glucosamine therapy for treating osteoarthritis //The Cochrane Database of Systematic Reviews, 2001, issue 1.
25. Towheed T.E. Maxwell L., AnastassiadesT.P., et al. Glucosamine therapy for treating osteoarthritis //The Cochrane Database of Systematic Reviews, 2005, issue 2.
26. Towheed T.E., Anastassiades T.S. Glucosamin and chondroitin for treating symptoms of osteosrthritis: evidence is widely touted but incomplete // JAMA.- 2000.- Vol. 283.- P. 1483-1484.
27. van der Kraan P.M., de Vries B.J., Vitters E.L., et al. The effect of low sulphate concentrations on the glycosaminoglycan synthesis in anatomically intact articular cartilage of the mouse // Orthop. Res. – 1989.- Vol. 7.- P. 645-653.
28. van der Kraan P.M., Vitters E.L., de Vries B.J., et al. High susceptibility of human articular cartilage glycosaminoglycan synthesis to changes in inorganic sulfate availability // Orthop. Res. – 1990.- Vol. 8.- P. 565-571.
29. Zhang W., Doherty M., Arden N., et al. EULAR evidence based recommendations for the management of hip osteoarthritis: report of a task force of the EULAR Standing Committee for International Clinical Studies Including Therapeutics (ESCISIT) // Ann. Rheum. Dis. – 2005.- Vol.64, №5.- Р.669-681.