Референтной лаборатории по диагностике онкогематологических заболеваний у детей — 10 лет

В последние десятилетия заболеваемость злокачественными новообразованиями в Украине среди детей составляет 1300-1350 больных в год (10,0-11,2 на 100 тыс. детей). Это несколько выше, чем в Российской Федерации (9,7), но меньше, чем в Германии

В последние десятилетия заболеваемость злокачественными новообразованиями в Украине среди детей составляет 1300-1350 больных в год (10,0-11,2 на 100 тыс. детей). Это несколько выше, чем в Российской Федерации (9,7), но меньше, чем в Германии (13,8) и США (13,6) [4].

В структуре онкологической патологии у детей в возрасте 0-14 лет первое место занимают лейкозы и лимфомы (50,8% у мальчиков и 45,9% у девочек), опухоли ЦНС и периферической нервной системы (соответственно 14,8 и 14,0%), новообразования костей (7,7 и 6,9%), опухоли почек (6,2 и 7,6%). Опухоли щитовидной железы, частота возникновения которых значительно увеличилась после аварии на ЧАЭС, у мальчиков (2,2%) и у девочек (4,4%).

По инициативе Министерства здравоохранения Украины в октябре 2002 года проведена конференция «Современная педиатрическая онкогематология в Украине: достижения и перспективы развития», в которой приняли участие ведущие отечественные специалисты, известные онкологи Германии и Австрии (профессора Х. Й. Римм, Г. Шеллонг, Й. Риттер, Г. Манн, А. Петерс). На конференции были подведены некоторые итоги в области диагностики опухолевых заболеваний кроветворной и лимфоидной тканей.

Решение о создании референтной лаборатории (РЛ) в составе Кооперативной группы по лечению лейкозов и лимфом у детей Украины было принято в 1993 году во время проведения украинско-немецкой конференции гематологов в г. Чернигове. В организации лаборатории непосредственно участвовали сотрудники отдела иммуноцитохимии Института экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р. Е. Кавецкого НАН Украины, ведущие детские гематологи Украины В. Д. Дроздова, С. Б. Донская, Е. А. Лившиц и другие, профессор Г. Шеллонг и доктор А. Райтер. Гематологи Германии оказали ценную научно-методическую помощь, предоставили реактивы, необходимые для проведения цитохимических исследований.

В первые годы референтная лаборатория проводила диагностические исследования для 9 онкогематологических центров, сегодня — для гематологических и онкологических отделений 18-20 областей Украины и АР Крым. За десять лет обследовано 4622 ребенка с острыми лейкозами, хроническим миелолейкозом, миелодиспластическими синдромами, неходжкинскими злокачественными лимфомами и лимфогранулематозом (табл.1).

В течение всего периода работы референтной лаборатории собирался архив цитологических препаратов (мазков крови, костного мозга, пунктатов и отпечатков лимфатических узлов, тонкоигольных пунктатов опухолей), которые могут быть востребованы для проведения онкоэпидемиологических и других научных исследований. Предварительный диагноз, установленный в детских онкогематологических отделениях областных лечебных учреждений, в референтной лаборатории был изменен у 6,5% больных и уточнен (иногда существенно) у 40% пациентов, у 7,9% больных первоначально установленный диагноз подтвержден не был.

Данные о больных из различных лечебных учреждений, материал для исследования которых поступал в референтную лабораторию для выполнения диагностических исследований на протяжении двух последних лет, представлен в таблице 2.

В РЛ сегодня обращаются врачи из различных лечебных учреждений Украины. Для проведения диагностических исследований необходимо направить следующие материалы: мазки крови (6-10 штук), мазки костного мозга (6-10 шт), пробы цельной крови (на гепарине — 5-15 мл), экссудаты из серозных полостей, спинномозговую жидкость, отпечатки и пунктаты лимфатических узлов, тонкоигольные пунктаты из опухолей.

Направляемый материал сопровождают краткой выпиской из истории болезни с указанием предполагаемого диагноза и доставляют в РЛ родственники больных, медицинские работники, курьеры, иногда бандеролью или посылкой. Срок исследования — от 3 до 5 дней. Заключение об окончательном диагнозе лаборатория сообщает в соответствующие онкогематологические отделения по телефону, некоторые заключения отсылают по почте.

Комплекс диагностических исследований включает цитоморфологическое и цитохимическое изучение препаратов, проведение иммуноцитохимического анализа с использованием широкой панели моноклональных антител к линейно-специфическим, дифференцировочным и активационным антигенам лейкоцитов, к онкофетальным, ткане- и органоспецифическим антигенам, белкам цитоскелета, продуктам экспрессии онкогенов [2, 3].

В комплекс диагностических исследований входят: цитоморфологическое изучение препаратов, окрашенных по Паппенгейму; цитохимические исследования — определение уровней миелопероксидазы, кислой и щелочной фосфатаз (ЩФ), кислой неспецифической эстеразы, нафтол-AS-D-хлорацетатэстеразы, проведение PAS-реакции.

Иммунофенотипирование (ЩФАЩФ, АВС-щелочная фосфатаза, АВС-пероксидаза) заключается в определении моноклональных антител: Т-лимфоидных (CD3, CD4, CD2, CD7, CD8, CD5, CD1a), В-лимфоидных (CD10, CD19, CD20, CD22, CD21, IgM, ж, l), миелоидных (МПО, CD33, CD13, CD14, CD15, CD61, CD62, CD71, CD41, CD42, гликофорин А); линейно-неспецифических (HLA-DR, CD34); моноклональных антител к онкофетальным, ткане- и органоспецифическим антигенам (РЭА, ЦК, Vim, Dec, NF, NSE, S-100, NBL, MIC2/CD99).

Иммунофенотипирование злокачественно трансформированных клеток проводится у 40% больных (преимущественно с различными формами острого лимфобластного лейкоза, вариантами острого миелобластного лейкоза МО, М6, М7 при дифференциальной диагностике лимфом и опухолей из малых округлых клеток) с использованием свежих жизнеспособных клеток, выделенных в градиенте плотности фиколл-верографина. У иногородних больных при необходимости иммуноцитохимические исследования выполняют непосредственно в мазках крови, костного мозга, цитологических препаратах лимфатических узлов и опухолей, полученных при пункционной биопсии. Модифицированные с этой целью иммуноферментные цитохимические методы (ЩФАЩФ, АВС-ЩФ, АВС-пероксидаза) в качестве know-how применяются только в референтной лаборатории, они позволяют с помощью обычной световой микроскопии идентифицировать природу патологических клеток при небольшом их содержании в исследуемом материале.

При диагностике острых лейкозов и неходжкинских злокачественных лимфом у детей мы используем широкоизвестную франко-американо-британскую классификацию (FAB), схему, предложенную в 1995 году Европейской группой по иммунологическому изучению лейкозов (EGIL), пересмотренную европейско-американскую классификацию лимфоидных новообразований (REAL) и новую классификацию ВОЗ (1999) опухолевых заболеваний кроветворной и лимфоидной тканей, основанную на учете цитоморфологических, цитохимических, иммунофенотипических особенностей трансформированных клеток и данных молекулярно-генетического анализа [5-7].

Из 571 больного, обследованного в 2001 году, дети с острыми лейкозами составили 34%, неходжкинскими злокачественными лимфомами — 22,5%, остальные — с ювенильным хроническим миелолейкозом, миелодиспластическими синдромами, апластической анемией и другими заболеваниями крови неопухолевой природы (рис.).

Во время диагностики онкогематологических заболеваний в РЛ мы руководствуемся следующими принципами.

Принципы диагностики острых лейкозов различного происхождения

• ОЛЛ^* с фенотипом стволовой гемопоэтической клетки CD34+CD38+/-HLA-DR+CD45RO+, lin-
• пре-пре-В-ОЛЛ(СD19+CD22+CD20-CD 10-сgm-)
• ОЛЛ «общего типа» (O-ОЛЛ): CD19+CD22+CD20+/-CDlO+сgm-
• пре-В-ОЛЛ: CD 19+CD22+CD20+/-CD 10+сgm+
• В-ОЛЛ CD19+CD22+CD20+CD10+sIg+
• Т1-ОЛЛ с фенотипом субкортикальных тимоцитов (CD7+CD2+cyCD3+CD5-CDla-CD4-CD8-) либо еще менее зрелых костномозговых предшественников тимоцитов;
• Т2-ОЛЛ с фенотипом кортикальных тимоцитов: CD7+CD2+sCD3+CD5+CDla+/-CD4+CD8+;
• ТЗ-ОЛЛ с фенотипом медуллярных тимоцитов (CD7+CD3+CD2+CD5+CDla+), либо CD4+, либо CD8+;
• Т4-ОЛЛ сgdТ-клеточным рецептором.
• МО-ОМЛ^** (CD34+CD33+CD13+CD38+CD10+HLA-DR+, в отдельных случаях CD7, МПО позитивна при определении с помощью моноклональных антител).
• М1-ОМЛ (CD33+CD13+CD15+CD64+).
• M2-OMЛ (CD15+CD16+CD13-CD33-CD38-HLA-DR-).
• МЗ-ОМЛ (HLA-DR- при вариабельной экспрессии панмиелоидных маркеров).
• М4-ОМЛ (цитохимические и иммунофенотипические признаки присутствия миелобластов (МПО+ХАЭ+) и монобластов (CD14+, КНЭ+, НЭ+).
• М5-ОМЛ (монобласты различной степени зрелости: CD15++CD14-CD15+CD14+CD14++CD15+/-).
• М6-ОМЛ (CD34+/-CD33+CD13+CD71+CD61+HLA-DR+).
• М7-ОМЛ (CD34+/-CD61+CD41+CD42+).

^* ОЛЛ — острый лимфобластный лейкоз; ^** ОМЛ — острый миелобластный лейкоз.

С учетом цитохимических и иммуноцитохимических признаков в группе острых лимфобластных лейкозов (ОЛЛ) выделяются лейкозы В-клеточной природы (пре-пре-В, общего типа, пре-В и В-клеточный), четыре варианта Т-клеточных ОЛЛ (с фенотипом субкортикальных, кортикальных, медулярных тимоцитов, сgd Т-клеточным рецептором), восемь разновидностей острых миелоидных лейкозов. Большинство вариантов ОМЛ выделяли на основе цитоморфологического исследования и использования стандартных цитохимических реакций (определение активности миелопероксидазы, кислой фосфатазы, неспецифической a-нафтил-ацетатэстеразы, нафтол-AS-D-хлорацетатэстеразы, PAS-реакция). Иммунофенотипические маркеры применяли преимущественно при выделении вариантов ОМЛ М0, М6, М7.

У 84,3% детей были диагностированы различные варианты ОЛЛ, у 15,7% — ОМЛ (табл.3), что соответствует соотношению этих основных форм острых лейкозов у детей США и большинства стран Европы. У 87,7% детей с ОЛЛ бластные клетки имели В-клеточное происхождение, у 12,3% — Т-клеточную природу.

Среди острых лейкозов миелоидного происхождения преобладали варианты ОМЛ М4 и ОМЛ М5. Примерно пятую часть из них составляли лейкозы, развившиеся у детей на протяжении первого года жизни.

В таблице 4 представлены данные о частоте различных форм неходжкинских злокачественных лимфом у наблюдавшихся нами больных детей. Все они, включая лимфому Беркитта спорадического типа, В- и Т-лимфобластную, возникающие из соответствующих лимфоидных клеток-предшественниц, относятся к опухолям с крайне злокачественным течением.

У детей с лимфомой Беркитта спорадического типа, как и у пациентов с В-ОЛЛ (лимфома Беркитта в стадии лейкемизации), в большинстве случаев диагноз устанавливался на основании характерных цитоморфологических и цитохимических признаков — наличия бластных клеток с интенсивно базофильной вакуолизированной цитоплазмой и слабой диффузной окраской при выявлении активности кислой фосфатазы и при PAS-реакции. Между ними размещались немногочисленные макрофаги со светлой цитоплазмой. При необходимости проводили дополнительное иммуноцитохимическое исследование.

Значительную группу пациентов составили дети с солидными опухолями из малых округлых клеток (нейробластомой, саркомой Юинга, эмбриональной рабдомиосаркомой), нередко метастазирующих в костный мозг. В этих случаях часто возникала необходимость в проведении дифференциальной диагностики с острыми лейкозами и со злокачественными лимфомами в стадии лейкемизации. Применявшиеся с этой целью иммуноцитохимические маркеры представлены в таблице 5.

Новые диагностические технологии, основанные на последних достижениях молекулярной иммунологии и генетики, способствуют более точному распознаванию различных форм гемобластозов и опухолей различных органов и систем у детей. Получаемые при этом результаты важны в прогностическом плане и являются определяющими при выборе соответствующих схем терапии. По данным сотрудничающих с нами детских онкогематологов, при лечении детей с L1 и L2 вариантами ОЛЛ по протоколам БФМ-90 в ведущих лечебных учреждениях Украины удалось добиться существенного повышения уровня 5-летней выживаемости (с 10-15 до 70-75%) и приблизиться к подобным показателям в США, Германии, Франции. Достигнут также определенный прогресс в лечении детей с лимфомой Беркитта спорадического типа, нейробластомой, саркомой Юинга.

В деятельности РЛ важное место занимают повышение квалификации специалистов, выступления сотрудников с лекциями и докладами на научных конференциях, проведение ежегодных научно-практических семинаров, издание методических рекомендаций.

По масштабу и уровню проводимых исследований работающая на общественных началах и энтузиазме сотрудников РЛ не уступает центрам подобного типа, функционирующим в Великобритании, Германии и Испании (в последней стране центр создан на средства фонда для борьбы с лейкемией, основанного Х. Карреасом). У 50-60% первичных пациентов со злокачественными новообразованиями различной локализации, ежегодно регистрируемых в Украине, диагноз уточняется в нашей лаборатории.

Мы полагаем, что наш накопленный опыт может быть использован и в других регионах, в Украине следовало бы создать при поддержке государства еще, как минимум, 2-3 подобных диагностических центра [7]. Средства, необходимые для их оснащения оборудованием и реактивами, подготовки квалифицированных кадров, не столь уж велики. Без таких диагностических центров невозможно применять новые методы терапии, которые способствуют увеличению продолжительности жизни больных.

Мы выражаем признательность и благодарность всем, кто оказывает постоянную помощь и поддержку в нашей работе: Киевской городской госадминистрации (А. А. Омельченко, В. Г. Бедный), Главному управлению здравоохранения г. Киева (Р. Н. Макомела, В. В. Бычков), французскому медицинскому центру «Дети Чернобыля» (М.-Л. Симонэ), д-ру Н. Имамура (Хиросима, Япония).

Литература

1. Возіанов О.Ф., Москаленко В.Ф., Гойда Н.Г., Новак В.Л., Перехрестенко П.М. Сучасні проблеми та перспективи розвитку гематології в Україні. Гематологія та трансфузіологія, 2002, № 2, с. 5-9.
2. Глузман Д.Ф., Абраменко И.В., Скляренко Л.М., Надгорная В.А. Лабораторная диагностика онкогематологических заболеваний. Киев, Морион, 1998, 336 с.
3. Глузман Д.Ф., Абраменко И.В., Скляренко Л.М., Крячок И.А., Надгорная В.А. Диагностика лейкозов. Атлас и практическое руководство. Киев, Морион, 2000, 224 с.
4. Федоренко З.П., Гулак Л.О., Горох Є.Л., Сумкіна О.В., Ри-жов А.Ю., Куценко Л.Б., Романов Д.В. Рак в Україні: захворюваність, смертність, показники діяльності онкологічної служби. Бюлетень Національного канцер-реєстру України-2002, с. 73.
5. Bennet J.M., Catovsky D., Daniel M.T. Proposal for the recognition of minimally differentiated acute myeloid leukemia (AML-MO). Br J. Haematol 1991; 78: 325-9.
6. Mason D.Y., Harris N.L., eds. Human lymphoma: clinical implications of the REAL classification. London, Berlin, Heidelborg: Springer-Verlag 1999: 554 p.
7. Bain B.J. Leukemia diagnosis. 2d ed. Oxford: Blakwell Sci Ltd, 1999: 200 p.