ИННО-ЛИА сифилис усовершенствованный инструкция, аналоги и состав

«ІННО-ЛІА Сифіліс удосконалений»,

тест-системи для підтвердження наявності антитіл до антигенів Тreponema pallidum у сироватці або плазмі крові людини методом лінійного імуноферментного аналізу

Тест-система „ІННО-ЛІА Сифіліс удосконалений» являє собою набір реагентів, що включає:

• імуносорбент, тест-смужки ІННО-ЛІА Сифіліс із нанесеними рекомбінантними антигенами: ТрN47, ТрN17, ТрN15 і синтетичний пептид ТmpА;

• позитивний контрольний зразок (К+), інактивований - сироватка крові людини, що містить антитіла до Тreponema pallidum, прозора безбарвна рідина;

• негативний контрольний зразок (К-), інактивований - сироватка крові людини, що не містить антитіла Тreponema pallidum, прозора безбарвна рідина;

• кон”югат - антитіла козячі до IgG людини, мічені лужною фосфатазою, прозора рідина яскраво-червоного кольору;

• хромоген - прозора рідина яскраво-жовтогарячого кольру;

• розчин для розведення зразків — фосфатний буферний розчин, прозора рідина яскраво-зеленого кольору;

• відмивний розчин, 5-разовий - фосфатний буферний розчин, прозора рідина яскраво-блакитного кольору;

• стоп-реагент - 0,1 М сірчана кислота, прозора безбарвна рідина. Набір розрахований на 20 визначень.

ПРИЗНАЧЕННЯ

Підтвердження наявності антитіл проти Тreponema pallidum у зразках сироватки або плазми крові людини методом лінійного імуноферментного аналізу (лінійним імуноблотом). Тест використовується як додатковий при дослідженні зразків сироватки або плазми крові людини, що показали при скринінгу (у РПР, РПГА або ІФА) позитивний результат.

Принцип проведення аналізу

Три рекомбінантних білки ТрN47, ТрN17, ТрN15 і синтетичний пептид ТmpА, які являють собою антигенні детермінанти Тreponema pallidum, нанесені у вигляді окремих ліній на мембрану з нейлону, яка прикріплена до пластикової підкладки, що разом утворює тест-смужку.

Антитіла до Тreponema pallidum виявляються за їх зв”язуванням з антигенами ТрN47, ТрN17, ТрN15 і ТmpА, нанесеними на тест-смужку у вигляді окремих ліній. На кожну тест-смужку також нанесені чотири контрольні лінії: антистрептавидинова лінія (іммобілізований стрептавидин); лінія за інтенсивністю забарвлення відповідає 3+ позитивному контролю (іммобілізовані антитіла до Ig людини), яка також є контролем внесення зразка; лінія за інтенсивністю забарвлення відповідає 1+ позитивному контролю (іммобілізовані IgG людини); лінія за інтенсивністю забарвлення відповідає критичному рівню ± (іммобілізовані IgG людини).

Тест-система «ІННО-ЛІА Сифіліс удосконалений» грунтується на принципі імунного аналізу. Досліджуваний зразок інкубується у ванночці разом з тест-смужкою. Специфічні антитіла, якщо вони присутні в зразку, зв'язуються з антигенами, нанесеними на тест-смужку. Потім у ванночку вносяться козячі антитіла до IgG людини, мічені лужною фосфатазою. Ці антитіла зв'язуються з будь-яким комплексом «антиген Тreponema pallidum - антитіло», що сформувався на смужці на попередньому етапі ІФА-реакції. Інкубація тест-смужки із хромогеном дає темно - коричневий колір на тих лініях, де присутні специфічні антитіла (з інтенсивністю пропорційно кількості антитіл). Розвиток забарвлення зупиняють додаванням сірчаної кислоти.

У випадку, якщо досліджуваний зразок не містить специфічних антитіл, зміни забарвлення смужок з нанесеними антигенами ТрN47, ТрN17, ТрN15 і ТmpА не відбувається: комплекс «антиген Тreponema pallidum — антитіло» на смужках не утворюється, і антитіла до IgG людини, мічені лужною фосфатазою, не можуть з ним зв'язатися.

Реагенти: опис, приготування й рекомендовані умови зберігання

За умови зберігання при температурі від 2 до 8 °С всі реагенти тест-системи, включаючи тест-смужки, стабільні протягом усього терміну зберігання, зазначеного на упаковці. Реагенти не заморожувати.

Всі реагенти й пластмасову пробірку, що містить тест-смужки, необхідно витримувати при температурі від 18 до 25 °С протягом приблизно 30 хв до використання й поміщати в холодильник (температура від 2 до 8 °С) відразу після використання.

Зміна зовнішнього вигляду компонентів набору свідчить про їхню непридатність.

Після відкриття пластикової пробірки, що містить стрипи, невикористані стрипи будуть стабільні протягом 16 тижнів, якщо їх зберігати при температурі від 2°С до 8°С у щільно закритій пробірці з капсулою осушувача.

Реагенти, що входять до складу тест-системи:

Інгредієнт		Кількість		Опис
Імуносорбент тест-смужки ІННО-ЛІА Сифіліс із нанесеними антигенами		20 шт		Прозора пластикова пробірка, закрита пробкою, яка містить 20 тест-смужок ІННО-ЛІА Сифіліс з нанесеними у вигляді лінії антигенами
К+ - позитивний контрольний зразок, інактивований		120 мкл		Інактивована сироватка крові людини, що містить антитіла до антигенів Тreponema pallidum з 0,01 % метилізотіазолоном / 0,1 % хлорацетамідом як консервант
К- - негативний контрольний зразок, інактивований		120 мкл		Нормальна сироватка крові людини з 0,01 % метилізотіазолоном /0,1 % хлорацетамідом як консервант
Кон”югат		45 мл		Козячі антитіла до IgG людини (червоного кольору), мічені лужною фосфатазою, у трис-буферному розчині, який містить стабілізатори білків бичачого походження, детергент і 0,01% метилізотіазолон/ 0,1 % хлорацетамід (САА) як консервант
Хромоген		45 мл		3-індолілфосфат/ нітротетразоліум блакитний у диметилформаміді, 0,01 % метилізотіазолон /0,1% хлорацетамід як консервант
Розчин для розведення зразків	30 мл		Фосфатний буфер (зеленого кольору), що містить хлорид натрію, детергент, стабілізатори білків бичачого походження й 0,3% хлорадетамід як консервант
Відмивний розчин, 5 - разовий	45 мл		Трис-Буфер, що містить хлорид натрію, детергент, 0,02 % бромонітродіоксан як консервант (блакитного кольору). Розводиться 5 разів. Розведений розчин зберігається 2 тижні при температурі від 2 до 8°С.
Стоп-реагент	45 мл		0,1 % сірчана кислота
Рамка з ванночками для інкубації тест-смужок	2 шт.		Містить 12 ванночок для інкубації тест-смужок
Пластини липкі	5 шт		Пластикова пластина, липка, використовується як кришка для ванночки під час інкубації
Трафарет-схема	1 шт		Для ідентифікації ліній після проведення аналізу
Форма для обліку результатів тесту	1 шт		Для обліку результатів і зберігання використаних тест-смужок

Матеріали, що не входять до складу тест-системи, але потрібні для проведення аналізу

-                      Дистильована або деіонізована вода.

-                      Прецизійні піпетки на 10 мкл, 20-200 мкл і 200-1000 мкл з одноразовими наконечниками.

-                      Орбітальний шейкер або ротатор (див. розділ «Вказівки щодо процедури

-                      інкубації»).

-                      Вортекс або інший аналогічний струшувач.

-                      Мірні циліндри: 25, 50,100 і 200 мл.

-         Пінцет для роботи зі стрипами.

-         Рукавички.

-         Таймер (1 година, розрідження - 1 хв).

-         Додаткові матеріали:

• фен або повітряний інкубатор на 37 °С;

• піпетка-дозатор для дозування стоп-реагенту, кон”югата, хромогену й відмивного розчину, а також одноразові флакони;

• вакуумний аспіратор, що містить 5% гіпохлорид натрію;

• одноразові флакони для приготування робочих розчинів кон”югата й хромогену.

Техніка безпеки й охорона навколишнього середовища

Всі компоненти крові й біологічних матеріалів повинні розглядатися як потенційно інфекційні й оброблятися також. Аналіз повинен проводити тільки навчений персонал. З усіма залишками компонентів крові й біологічних матеріалів необхідно поводитися відповідно до встановлених норм безпеки:

- автоклавування протягом 15 хв при температурі 121 °С;

- спалювання.

Рідкі відходи можуть бути оброблені розчином гіпохлориту натрію (кінцева концентрація гіпохлориту повинна бути рівна ± 1 %). Залишити на ніч до утилізації.

УВАГА! Нейтралізуйте рідкі відходи, які містять кислоту, перед додаванням гіпохлориту натрію.

Використовуйте індивідуальні захисні засоби (рукавички й захисні окуляри) при роботі з небезпечними й інфекційними матеріалами.

Утилізуйте відходи згідно з національним або федеральним законами, отримуйтеся законодавства по охороні навколишнього середовища.

Не аспіруйте стоп-реагент у посудину з рідкими відходами, яка містить гіпохлорит натрію.

Зберігання й транспортування реагентів

Тест-система „ІННО-ЛІА Сифіліс удосконалений» можна використовувати для тестування сироватки або плазми крові людини, що знаходяться у пробірках, які містять цитрат, гепарин або ЕДТА як антикоагулянт.

Неодноразово заморожені й відталі зразки можуть давати при тестуванні помилкові результати.

Перед зберіганням сироватка або плазма повинні бути відділені від кров'яного згустку або клітин крові центрифугуванням.

Зберігайте зразки, взяті для аналізу, при температурі від 2 до 8 °С. Якщо необхідно зберігати зразки більше 1 тижня, заморозьте зразки в аліквотах і зберігайте при температурі мінус 20 °С і нижче.

Будь-яке попереднє розведення досліджуваних зразків можна робити з використанням нормальної сироватки людини.

Не використовуйте зразки, які зазнали теплової обробки.

Зауваження щодо процедури тестування

1. Не використовуйте набір після закінчення терміну придатності.

2. Не використовуйте в одній постановці компоненти із тест-систем різних серій.

3. Уникайте мікробної контамінації реагентів.

4. Переконайтеся, що зразки й контролі, взяті для аналізу, гомогенні.

5. Використовуйте новий наконечник для піпетки для відбору кожного нового зразка.

6. Переконайтеся, що тест-смужка знаходиться у ванночці мембраною угору (при цьому номер на тест-смужці повинен бути чітко видний).

7. Всі етапи інкубації проводьте з використанням орбітального шейкера або ротатора (див. розділ «Вказівки щодо процедури інкубації»).

8. Забарвлені тест-смужки необхідно висушувати повністю, щоб уникнути помилкової інтерпретації результатів через появу слабко помітних смуг після додавання стоп-реагенту.

9. Для запобігання висиханню зразків накривайте ванночки спеціальною липкою пластиною.

10. Як не використані, так і проявлені тест-смужки повинні зберігатися подалі від джерел яскравого світла й тепла.

11. Не використовуйте повторно ванночки й стрипи.

12. Використовуйте рукавички під час роботи.

13. Щоб уникнути контамінації не відкривайте флакони зі зразками над ванночкою, коли додаєте зразок у розчин для розведення зразків.

14. До роботи з даною тест-системою може бути допущений лише кваліфікований персонал, що має сертифікат з клінічної лабораторної діагностики.

15. При роботі з тест-смужками не торкайтеся нейлонової мембрани, завжди маніпулюйте тест-смужкою, тримаючи її за пластикову підкладку.

16. Працюйте гігієнічно: уникайте чхання й кашляння в безпосередній близькості від тест-смужок.

17. Не кладіть папір на верхню поверхню тест-смужок, доки вони остаточно не висохнуть.

Проведення аналізу

Перш ніж приступити до роботи, будь ласка, ознайомтеся з розділом «Зауваження щодо процедури тестування».

1. Використовуйте рамку з необхідною кількістю ванночок, враховуючи, що при кожній постановці повинні бути використані позитивний і негативний контролі. Ванночки можна ідентифікувати за маркуванням на одному з кінців.

2. Внесіть 1 мл розчину для розведення зразків у кожну ванночку.

3. Внесіть по 10 мкл зразків або контролю у відповідні ванночки.

4. Візьміть необхідну кількість тест-смужок ІННО-ЛІА Сифіліс і опустіть по одній у кожну ванночку, мембраною угору за допомогою пінцета.

Тест-смужки повинні бути повністю занурені в рідину.

5.Закрийте ванночки липкою пластиковою пластиною. Інкубуйте зразки протягом ночі (16 ±2 години) при температурі від 18 до 25 °С на орбітальному шейкері або ротарі (див. розділ «Процедура інкубації»). Обережно зніміть пластикову пластину з ванночок після закінчення інкубації.

1. Відмийте кожну тест-смужку по 3 рази 1 мл робочого відмивного розчину, кожне відмивання триває 5 хв (див. розділ «Процедура відмивання»).

2. Внесіть по 1 мл розчину кон”югата в кожну ванночку.

3. Інкубуйте протягом 30 хв при температурі від 18 до 25 °С на орбітальному шейкері або ротаторі.

4. Відмийте кожну тест-смужку по 3 рази 1 мл робочого відмивного розчину, кожне відмивання триває 5 хв (див. розділ «Процедура відмивання»).

5. Внесіть по 1 мл хромогену в кожну ванночку.

6. Інкубуйте протягом 30 хв при температурі від 18 до 25 °С на орбітальному шейкері або інкубаторі-струшувачі.

7. Видаліть рідину з ванночок. Додайте по 1 мл стоп-реагенту в кожну ванночку.

8. Інкубуйте ванночки зі стоп-реагентом протягом 10-30 хв при температурі від 18 до 25 °С на орбітальному шейкері або інкубаторі-струшувачі.

9. Видаліть стоп-реагент із ванночок.

10. Вийміть тест-смужки з ванночок за допомогою пінцета й покладіть їх мембраною угору на фільтрувальний папір. Результати враховують після того, як тест-смужки повністю висохнуть. Не прикріплюйте тест-смужки до паперу скотчем за мембрану. Для прискорення висихання покладіть тест-смужки у повітряний інкубатор (37 °С) на 30 хв або використайте фен протягом 1 хв. Використані тест-смужки зберігають свій колір, якщо їх зберігати в темряві.

Процедура відмивання

Після нічної інкубації ретельно видаліть липку пластину.

Ретельно видаліть рідину з ванночки.

Тримайте рамку під кутом, щоб вся рідина стекла у той бік ванночки, де знаходяться не покриті мембраною пластикові «основи» стрипів).

Видаліть рідину піпеткою ( бажано користуватися вакуумним аспіратором).

Додайте 1 мл робочого відмивного розчину в кожну ванночку й перемішуйте вміст ванночки протягом 5 хв, використовуючи орбітальний шейкер.

Видаліть рідину піпеткою, тримаючи ванночку під кутом, як описано вище.

Повторіть цю процедуру 3 рази.

Зауваження:

• Не дозволяйте тест-смужкам висихати між етапами процедури відмивання.

• Переконайтеся, що при аспірації не відбувається порушення цілісності мембрани тест-смужок.

• Щоб уникнути перехресної контамінації завжди використовуйте чисте аспіруюче обладнання із посудиною-пасткою, яка містить дезінфікуючий розчин.

• Під час процедури відмивання стежте, щоб тест-смужка була повністю занурена у відмивний розчин.

• Якщо необхідно, регулюйте швидкість обертання орбітального шейкера або ротатора.

•Уникайте розбризкування відмивного розчину через краї ванночок.

Процедура інкубації

Завжди додаються об”єми, вказані в розділі «Проведення аналізу». Додавання надлишку реактивів може призвести до розпліскування рідини через краї ванночок і викликати перехресну контамінацію.

Швидкість, яку розвиває орбітальний шейкер або ротатор, є критичною для досягнення ефективного забарвлення ліній і досягнення максимальної чутливості аналізу.

Всі етапи інкубації тест-смужок (зі зразком, кон”югатом, хромогеном і стоп-реагентом), а також етапи відмивання повинні здійснюватися на орбітальному шейкері або ротаторі.

Під час інкубації або відмивання тест-смужка повинна бути повністю занурена в рідину мембраною угору.

Орбітальний шейкер або ротатор повинен перемішувати вміст ванночки таким чином, щоб тест-смужка рухалася у ванночці «туди-сюди», а рідина обмивала тест-смужку, але не переливалася через край ванночки.

Рекомендації для кругового шейкера й ротатора

Для орбітального шейкера:

• діаметр кругового руху повинен бути рівним або більшим 13 мм.

• рекомендована швидкість для руху з ексцентриситетом 13 мм повинна становити 160 об/хв.

• рекомендована швидкість для руху з ексцентриситетом 24 мм повинна становити 90 об/хв.

Для ротатора:

• амплітуда хитання повинна становити не більше 11 мм, щоб запобігти переливанню рідини.

• рекомендована швидкість - 35 об/хв.

Облік результатів

Рівень інтенсивності забарвлення антигенних ліній може мінятися від «-» до «4+». Для якісної оцінки інтенсивності забарвлення антигенних ліній проводять порівняння з інтенсивністю забарвлення контрольних ліній. Розташування й ідентифікація антигенів і контрольних ліній на тест-смужці наведені в таблиці (розташування зазначених ліній на тест-смужці зверху вниз).

Ідентифікаційний номер тест-смужки

Стрептавидин

Антитіла до IgG людини, рівень інтенсивності забарвлення відповідає 3+

IgG людини, рівень інтенсивності забарвлення відповідає 1±

IgG людини, рівень інтенсивності забарвлення відповідає ±.

ТрN47

ТрN17

ТрN15

ТmpА.

Інтенсивність реакції на контрольних лініях кожної тест-смужки використовується для оцінки реактивності для кожного антигену на даній тест-смужці.

Для полегшення оцінки результату додається спеціальна форма для обліку результатів.

Інтенсивність реакції антигенних ліній (R)		Оцінка (рівень)
Менш інтенсивна, ніж ±	R < ±	-
Інтенсивність, рівна ±	R = ±	±
Більш інтенсивна, ніж ±, але менш інтенсивна, ніж 1+ або рівна їй	± < R < 1+	1+
Більш інтенсивна, ніж 1 +, але менш інтенсивна, ніж 3+	1+ < R < 3+	2+
Інтенсивність, рівна 3+	R = 3+	3+
Більш інтенсивна, ніж 3 +	R > 3+	4+

Проявлені тест-смужки прикріплюються до форми для обліку результатів так, щоб контрольні лінії інтенсивності 3+ у всіх тест-смужок і відповідна лінія на малюнку форми були на одному рівні.

Перед зчитуванням результатів зразків оцінюють правильність постановки, використовуючи результати контрольних тест-смужок (К+ і К-) і контрольних ліній на кожній тест-смужці.

Валідація

Результати на окремій тест-смужці можна враховувати , якщо :

• Контрольні лінії інтенсивностей ±, 1+, 3+ чітко розрізняються.

• Інтенсивність контрольної лінії 3+ більша, ніж лінії 1+, а інтенсивність 1+ лінії, більша, ніж лінії ±.

• Контрольна лінія стрептавидину не забарвлена.

Примітка: слабке забарвлення контрольної лінії може спостерігатися у зразках з високим вмістом IgG (вище нормального діапазону IgG). Розведіть такий зразок у 2 рази нормальною сироваткою людини (однак розведення може призвести до зниження чутливості).

Інтерпретація результатів

Зразок є НЕГАТИВНИМ:

-         якщо всі лінії негативні.

-         якщо інтенсивність забарвлення однієї антигенної лінії ±, інші негативні.

Зразок є ПОЗИТИВНИМ:

-якщо інтенсивність забарвлення двох або більше антигенних ліній ± або більше.

Зразок вважається НЕВИЗНАЧЕНИМ:

- якщо інтенсивність забарвлення однієї антигенної лінії 1+ або більше.

Інтенсивність забарвлення антигенних ліній при зчитуванні результату
Немає смуги	Одна смуга	Дві або більше смуг
Одна смуга = 0,5	Інтенсивність забарвлення ≥ 1	Інтенсивність забарвлення ≥ 0,5
Негативний	Невизначений	Позитивний

ПРИМІТКА:

-    якщо отримано невизначений результат, аналіз необхідно повторити. При одержанні аналогічного результату повторне дослідження провести через 2 тижні;

-    якщо зразок реагує з контрольною стрептавидиновою лінією більш ніж на ±, інша лінія також може бути позитивною через неспецифічну реакцію, оскільки вона теж містить стрептавидин. У цьому випадку результат вважається як такий, що НЕ ІНТЕРПРЕТУЄТЬСЯ. Рекомендується протестувати інший зразок сироватки або плазми крові від того ж пацієнта.

Обмеження процедури

Для досягнення оптимальної якості проведеного аналізу необхідно чітко дотримуватися інструкції.

Негативний результат не виключає, проте, можливості інфікованості пацієнта Тreponema pallidum .

Використання розведених зразків може давати помилкові результати.

Форма випуску

Тест-система випускається у вигляді упакованого в коробку набору.

1. Імуносорбент - тест-смужки ІННО-ЛІА Сифіліс із нанесеними антигенами в пластиковій прозорій пробірці із пластмасовою пробкою, в яку вмонтована капсула  силікагелю, 20 шт.1 проб.

2. К+ - позитивний контрольний зразок, інактивований, 120 мкл у скляному флаконі на 5 мл, в який упаяна конічна скляна пробірка; флакон закупорений пластмасовою білою кришкою, що загвинчується. 1 фл.

1. К- - негативний контрольний зразок, інактивований, 120 мкл у скляному флаконі на 5 мл, в який упаяна конічна скляна пробірка; флакон закупорений пластмасовою чорною кришкою, що загвинчується. 1 фл.

2. Кон”югат - 45 мл у поліетиленовому флаконі на 50 мл з білого прозорого пластику із червоною пластмасовою кришкою, що загвинчується. 1 фл.

3. Хромоген - 45 мл у непрозорому поліетиленовому флаконі на 50 мл із пластмасовою коричневою кришкою, що загвинчується. 2 фл.

4. Розчин для розведення зразків - 30 мл у поліетиленовому флаконі на 50 мл із прозорого пластику білого кольору із пластмасовою кришкою, що загвинчується, зеленого кольору.1 фл.

7. Розчин для відмивання (х 5) концентрат — 45 мл у поліетиленовому флаконі на 50 мл із прозорого пластику білого кольору із пластмасовою кришкою синього кольору, що загвинчується. 1 фл.

8. Стоп-реагент - 45 мл у поліетиленовому флаконі на 50 мл із прозорого пластику білого кольору із пластмасовою кришкою, що загвинчується, білого кольору. 1 фл.

У коробку вкладають також:

Рамки з ванночками для інкубації тест-смужок, пластмасові2 шт.

Пластини липкі5 шт.

Трафарет-схему 1 шт.

Форму для обліку результатів 1 шт.

Інструкцію для застосування. 1 шт.

Термін придатності. Умови зберігання й транспортування.

Термін придатності - 12 місяців. Зберігання при температурі від 2 до 8 °С.

Транспортування при температурі від 2 до 8 °С. Допускається транспортування при температурі від 9 до 25 °С протягом трьох днів.