тест-система для определения РНК вируса гепатита C (ВГС) методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией после окончания амплификации Биофарма-АмплиСенс-ПЛР-HCV-FEP инструкция, аналоги и состав

Для детекції використовується флуоресцентний ПЦР-детектор «Джин»

(«ДНК-Технологія», Росія ) и «Ala-1» («BioSan», Латвія)

Загальна характеристика. Тест-система «Біофарма-АмпліСенс-ПЛР-HCV-FEP» призначена для виявлення РНК вірусу гепатиту С в плазмі периферичної крові методом зворотної транскрипції (ЗТ) і полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з гібридизаційно-флуоресцентною детекцією після закінчення реакції. Тест-система дає змогу виявляти РНК ВГС з чутливістю 250 МО/мл. Принцип тестування: виділення тотальної РНК з плазми крові разом з внутрішнім контрольним зразком; проведення реакції зворотної транскрипції РНК; проведення реакції ампліфікації з гібридизаційно-флуоресцентною детекцією продуктів ПЛР.

Тест-система розрахована на 48 тестів, включаючи контрольні зразки.

Склад. Тест-система складається з двох комплектів реагентів:

«Рібо-сорб-12»

Комплект реагентів для виділення РНК з плазми крові.

«ЗТ-ПЛР-HCV-FEP»

Комплект реагентів для проведення реакції зворотної транскрипції і реакції ампліфікації (з гібридизаційно-флуоресцентною детекцією після закінчення реакції).

Форма випуску.

«Рібо-сорб-12» для виділення РНК:

 

Реактив	Об'єм (мл)	Кіл-ть (шт)
Лізуючий розчин	5,8	4
Розчин для відмивання 1	8,0	4
Розчин для відмивання 3	15,0	4
Розчин для відмивання 4	8,0	4
Сорбент	0,4	4
РНК-елюент (DEPC-H2O)	1,0	4

До комплекту додаються наступні контрольні зразки:

НКЗ (негативний контрольний зразок)	0,5	4
ПКЗ-1 ВГС (позитивний контрольний зразок 1)	0,01	4
ВКЗ HCV-FRT (внутрішній контрольний зразок)	0,13	4

Комплект розрахований на виділення РНК із 48 проб, включаючи контрольні зразки.

Комплект зберігати при температурі від 2 до 8^oС.

 

«ЗТ-ПЛР-HCV-FEP» для реакції зворотної транскрипції і реакції ампліфікації:

Реактив	Об'єм (мл)	Кіл-ть (шт)
DTT ліофілізований	-	4
ЗТ-ПЛР-суміш-1-FEP	0,3	4
ЗТ-ПЛР-суміш-2-FEP/FRT	0,2	4
Полімераза (TaqF)	0,02	4
Ревертаза (M-MLV)	0,01	4
РНК-елюент	0,07	4
Мінеральна олія	4,0	1

До комплекту додаються:

ДНК-калібратор ПКЗ HCV	К3	0,025	4
ДНК-калібратор ВКЗ HCV	В3	0,025	4

Комплект розрахований на 64 реакції, включаючи контролі і калібратори.

Комплект зберігати при температурі від 2 до 8^оС. DTT, ОТ-ПЦР-суміш-1-FEP, ОТ-ПЦР-суміш-2-FEP/FRT, TM-ревертазу і полімеразу зберігати і транспортувати при температурі мінус 18±2 ^оС.

Матеріали й устаткування.

Для виділення РНК з клінічного матеріалу – ЗОНА 1:

-                   твердотільний термостат для пробірок типу «епендорф» на 25–100^оС;

-                   мікроцентрифуга для пробірок типу «епендорф» до 12 тис.g;

-                   вортекс-«мініген» або «мікроспін»;

-                   окремий набір автоматичних піпеток перемінного об'єму;

-                   окремий халат і одноразові гумові рукавички;

-                   одноразові поліпропіленові пробірки, що загвинчуються або щільно закриваються об'ємом 1,5 мл;

-                   одноразові наконечники для піпеток перемінного об'єму з аерозольним бар'єром;

-                   холодильник на 2–8^оС;

-                   вакуумний відсмоктувач з колбою-пасткою;

-                   ємність з дезинфікуючим розчином.

Для проведення реакцій зворотної транскрипції й ампліфікації, а також детекції продуктів ампліфікації – ЗОНА 2:

-                   ампліфікатор (наприклад, «Терцік», «ДНК-Технологія»);

-                   флуоресцентний ПЛР-детектор (наприклад, «Джин», «ДНК-Технологія»);

-                   ПЛР-бокс або окремий стіл, освітлюваний УФ-лампою;

-                   окремий набір автоматичних піпеток перемінного об'єму;

-                   одноразові поліпропіленові мікропробірки об'ємом 0,2 мл;

-                   одноразові наконечники для мікропіпеток з аерозольним бар'єром;

-                   холодильник на 2–8^оС і на мінус 20^оС;

-                   окремий халат і одноразові рукавички;

-                   ємність для скидання наконечників;

-                   комплект засобів для обробки робочого місця.

 

Підготовка до аналізу.

Збирання і збереження зразків.

Матеріалом для дослідження є плазма крові.

Одержання плазми крові.

Забір крові виконується натще з ліктьової вени одноразовою голкою (діаметр 0,8 – 1,1 мм) в одноразову пластикову пробірку з антикоагулянтом (3% розчин ЕДТА у співвідношенні 1:20) або спеціальну вакуумну систему типу «Venoject» (з ЕДТА), «Vacuett^®». Гепарин як антикоагулянт використовувати не можна! Пробірка закривається кришкою і перевертається кілька разів (для перемішування з антикоагулянтом). Плазму крові одержують центрифугуванням цільної крові (800 – 1600 g протягом 20 хв). Потім відбирають плазму окремими наконечниками з аерозольним бар'єром у стерильні пробірки типу «Епендорф» на 1,5 мл. Для виділення РНК використовується 100 мкл зразка плазми.

Зберігати плазму крові можна не більше трьох діб при температурі від 2 до 8°С, протягом 1 року – при температурі мінус 70 °С.

Допускається тільки одноразове заморожування-відтаювання матеріалу. При заморожуванні клінічного матеріалу його транспортування повинне проводитися в замороженому стані.

Запобіжні заходи.

Необхідно суворе дотримання правил облаштування, техніки безпеки, виробничої санітарії, протиепідемічного режиму й особистої гігієни при роботі в лабораторіях (відділеннях, відділах) санітарно-епідеміологічних установ.

Працюють тільки в одноразових рукавичках, використовують і змінюють при кожній операції одноразові наконечники для автоматичних піпеток з аерозольним бар'єром. Одноразовий пластиковий посуд (пробірки, наконечники) повинний скидатися в спеціальний контейнер, що містить дезинфікуючий 0,2%-ний розчин ДП-2Т, 5%-ний розчин хлораміну Б або в спеціальну ємність з 1Nрозчином соляної кислоти.

Аналіз проводиться в два етапи в двох окремих приміщеннях (зонах).

Усе лабораторне устаткування, у тому числі піпетки, штативи, лабораторний посуд, а також усі робочі розчини повинні бути строго стаціонарними. Забороняється їх перенос з одного приміщення в інше. Переміщення персоналу з кімнати для детекції продуктів ПЛР в інші приміщення заборонено.

Поверхні столів, а також приміщення, у яких проводиться постановка ПЛР, повинні обов'язково до початку і після початку робіт опромінюватися ультрафіолетовим світлом.

 

Проведення аналізу.

 

ЕТАП 1. Виділення РНК з плазми крові

Проводиться в ЗОНІ-1 -кімнаті для обробки клінічного матеріалу.

Порядок роботи.

1. Лізуючий розчин і розчин для відмивання прогріти при 60^оС до повного розчинення кристалів. Для виділення РНК з 12 проб, включаючи контролі, у баночку з лізуючим розчином додати стерильним наконечником з бар'єром 130 мкл внутрішнього контрольного зразку (ВКЗ). Вмісти ретельно перемішати. Суміш лізуючого розчину з ВКЗ зберігається не більш 30 хв.

2. У пробірки на 1,5 мл розкапати по 450 мкл приготовленої суміші лізуючого розчину з ВКЗ.

3. У кожну пробірку додати по 100 мкл досліджуваної плазми, закрити кришку і перемішати на вортексі. Осадити на центрифузі для скидання крапель рідини з кришки.

4. Для кожної панелі необхідно поставити негативний контрольний зразок (НКЗ) і позитивний контрольний зразок (ПКЗ-1 ВГС). Для негативного контролю в пробірку з лізуючим розчином додати 100 мкл негативного контрольного зразку (НКЗ). Для позитивного контролю в пробірку додати по 90 мкл НКЗ і по 10 мкл позитивного контрольного зразку (ПКЗ), перемішати на вортексі й осадити краплі рідини з кришки.

5. Ресуспендувати сорбент, інтенсивно перемішуючи на вортексі. Додати в кожну пробірку окремим наконечником по 25 мкл ресуспендованого сорбенту.

6. Перемішати вміст пробірок на вортексі і залишити на 10 хв при кімнатній температурі, ретельно перемішуючи кожні 2 хвилини.

7. Центрифугувати пробірки на мікроцентрифузі при 10.000 g протягом 1 хвилини.

8. Відібрати надосадову рідину з кожної пробірки окремим наконечником, використовуючи вакуумний відсмоктувач.

9. Додати в пробірки по 500 мкл розчину для відмивання 1. Перемішати на вортексі до повного ресуспендування сорбенту. Центрифугувати пробірки на мікроцентрифузі при 10.000 g протягом 1 хв. Відібрати надосадову рідину з кожної пробірки окремим наконечником, використовуючи вакуумний відсмоктувач.

10.  Додати в пробірки по 500 мкл розчину для відмивання 3. Перемішати на вортексі до повного ресуспендування сорбенту. Центрифугувати пробірки на мікроцентрифузі при 10.000 g протягом 1 хв. Відібрати етанол з кожної пробірки окремим наконечником, використовуючи вакуумний відсмоктувач.

11. Повторити відмивання розчином для відмивання 3.

12. Додати в пробірки по 500 мкл розчину для відмивання 4. Перемішати на вортексі до повного ресуспендування сорбенту. Центрифугувати пробірки на мікроцентрифузі при 10.000 g протягом 1 хв. Цілком відібрати ацетон з кожної пробірки окремим наконечником, використовуючи вакуумний відсмоктувач.

13. Висушити сорбент, помістивши пробірки з відкритими кришками в термостат на 56^оС на 10 хв.

14. Ресуспендувати сорбент у 50 мкл РНК-елюента. Прогріти в термостаті при температурі 56^оС 5 хв, перемішати на вортексі й осадити сорбент на центрифузі при 10.000 g протягом 2 хв.

Увага! Отриманий препарат РНК збереженню не підлягає, ЗТ-ПЛР повинна бути проведена протягом 20 – 30 хвилин після виділення РНК!

 

ЕТАП 2. Проведення реакції зворотної транскрипції (ЗТ) і ампліфікації

(Загальний об'єм реакції – 50 мкл, об'єм РНК-проби – 25 мкл)

Увага! При роботі з РНК необхідно використовувати тільки одноразові стерильні пластикові видаткові матеріали, що мають спеціальне маркірування «RNase-free», «DNase-free».

1. Відібрати необхідну кількість мікропробірок на 0,5 мл.

2. Приготувати реакційну суміш. Для цього в пробірку з ліофілізованим DTT послідовно додати 300 мкл ЗТ-ПЛР-суміши-1-FEP, 200 мкл ЗТ-ПЛР-суміши-2-FEP/FRT, 20 мкл полімерази і 10 мкл ТМ-ревертази, ретельно перемішати на вортексі й осадити краплі з кришки пробірки.

3. Внести в мікропробірки по 25 мкл готової реакційної суміші. Невикористані залишки реакційної суміші викинути.

4. Зверху розкапати по 1 краплі мінеральної олії для ПЛР (приблизно 25 мкл).

5. Узяти підготовлені для ЗТ-ПЛР пробірки. Під олію або безпосередньо на поверхню олії внести по 25 мкл РНК-проб, використовуючи наконечник з аерозольним бар'єром (При додаванні РНК-проб необхідно уникати попадання сорбенту в реакційну суміш для ЗТ-ПЛР).

6. Для кожної панелі необхідно поставити 4 контролі ПЛР:

Контроль ампліфікації ПКЗ – у пробірку внести 25 мкл ДНК-калібратора ПКЗ HCV К3,

Контроль ампліфікації ВКЗ – у пробірку внести 25 мкл ДНК-калібратора ВКЗ HCV В3.

Два негативних контроля – у пробірку внести 25 мкл РНК-елюента. Одна з пробірок з негативним контролем при аналізі результатів буде використана як фонова пробірка.

1. Помістити пробірки в ампліфікатор і запустити програму «50-95-60».

Програма «50-95-60» для ампліфікатора «Терцик»:

 

50^оС – 30 хв

95 ^оС – 15 хв

 42 цикла: 95 ^оС – 20 сек/ 60 ^оС – 20 сек/72 ^оС – 20 сек

1. Після закінченні виконання програми ампліфікації розпочати детекцію результатів.

ЕТАП 3 А. Детекція за допомогою флуоресцентного ПЛР-детектора «Джин»

(шляхом виміру флуоресцентного сигналу після закінчення ампліфікації).

Детекція за допомогою флуоресцентного ПЛР-детектора «Джин» проводиться відповідно до опису в «Паспорті детектора ПЛР флуоресцентний Джин».

Для детекції і обліку результатів використовуються стандартні настроювання* тесту «HCV» програми «Gene», задані за замовчуванням (Граничні значення для «-» 1,75; для «+» 2,1; для «ВК» 2,5).

* Настроювання тесту можна переглянути, вибравши меню «Настроювання», «Список тестів» у головному меню програми і, якщо значення змінені, потрібно відновити початкові значення, зазначені вище.

 

1. Включити прилад і запустити програму «Gene» на комп'ютері, приєднаному до приладу.

2. Задати протокол виміру. Ввести кількість вимірюваних зразків і кількість фонових пробірок (1), вибрати потрібну інфекцію (HCV) у списку тестів у графі «Тест», натиснути кнопку «OK» (кнопкою миші) і ввести послідовність детектуємих зразків (у колонку «Зразок»).

3. Як зразок, позначеного «ФОН» використовувати пробірку з негативним контролем.

4. Поставити пробірки в осередки модуля приладу «Джин» відповідно до заданої послідовності (спочатку перші 12 зразків) і запустити детекцію, натиснувши кнопку, позначену значком кольорової призми, у панелі активних кнопок (вгорі екрана). Після закінчення детекції першої групи замінити пробірки на наступну групу пробірок і продовжити вимірювання, натиснувши кнопку «OK». Після закінчення детекції вийняти пробірки і натиснути кнопку «OK».

 

Облік результатів.

1. Отримані дані інтерпретуються автоматично за допомогою програми «Gene» (стовпчик «Результат» на екрані). Позитивні зразки позначаються знаком «+» на червоному тлі; негативні зразки – знаком «-» на зеленому тлі; зразки, для яких отриманий сигнал, якому не можна однозначно інтерпретувати, що вимагають повторного аналізу, позначені знаком «?» на жовтому тлі; і зразки, у яких не детектується (не перевищує тла) як специфічний сигнал, так і сигнал ВКЗ, що потребує повторного аналізу, позначені знаком «нд» на жовтому тлі.

Приклад таблиці обліку отриманих результатів представлений нижче:

2.                Результат вважається достовірним тільки у випадку проходження позитивних і негативних контролів ампліфікації і негативного контролю виділення ДНК.

 

Таблиця. Оцінка результатів аналізу контрольних крапок

 

Контролі	Контрольований етап	Результат
ВКЗ	Виділення РНК		«+» (позитивний)
ПКЗ	Виділення РНК		«+» (позитивний)
НК	Виділення РНК		«-» (негативний)
К-	ПЛР		«нд» (негативний)
К+	ПЛР		«+» (позитивний)

 

1. Відсутність позитивного сигналу на каналі.

2.  Зразки, у яких відсутній специфічний сигнал, як по каналі «Специфіка» так і по каналі «ВК», позначаються в графі результатів знаком «нд» (не детектується) на жовтому тлі. Ці зразки вимагають повторного проведення ПЛР і детекції. У випадку якщо повторно отриманий результат «нд», потрібно повторити аналіз зразка, починаючи з етапу виділення. (Для зразка «K-» результат «нд» є нормою).

3. Відсутність позитивного сигналу в пробі з позитивним контролем ПЛР може свідчити про неправильно обрану програму ампліфікації і про інші помилки, допущені на етапі постановки ПЛР. У такому випадку необхідно провести ПЛР ще раз.

4. Якщо в негативному контролі (НК або К-) детектується позитивний сигнал, виходить, відбулася контамінація реактивів або проб. У цьому випадку результати аналізу по всіх пробах вважаються недійсними. Потрібно повторити аналіз проб, а також вжити заходів по виявленню джерела контамінації.

Чутливість виміру РНК ВГС тест-системи «Біофарма-АмпліСенс-ПЛР- HCV-FEP (Gene)» складає 250 МО/мл.

ЕТАП 3B. Детекція за допомогою флуоресцентного ПЛР-детектора «Ala-1»

(шляхом виміру флуоресцентного сигналу по закінченню ампліфікації).

Якщо виробником тест-системи не були задані параметри використовуваного тесту, то перед виміром флуоресцентного сигналу необхідно установити параметри тесту (див. нижче). Якщо такий тест існує, то необхідно переконатися у відповідності параметрів.

Порядок установки параметрів тесту «HCV-FEP».

1. Запустити програму «Ala-1» на комп'ютері, приєднаному до приладу.

2. У головному меню програми вибрати «Настроювання», «Tест».

3. Натиснути кнопку Новий (у верхньому правому куті).

4. В меню, що відкриється, задати назву тесту «HCV-FEP», натиснути кнопку ОК.

5. У групі параметрів Канали відзначити галочкою всі задіяні в тесті канали (FAM, HEX).

6. У групі УКЗ відзначити канал, що використовується для внутрішнього контролю (HEX).

7. У полях п- і п+ установити порогове значення для відношення сигнал/фон по каналі для детекції специфічної ДНК:

FAM: «п-» = 1.80, «п+» = 2.10;

В полі ВКЗ/фон задати порогове значення відносини сигналу по каналі для детекції ВКЗ до фону:

 «ВКЗ/фон» = 2.5.

1. У групі параметрів Рівень фону установити значення флуоресценції, припустимі для фонових пробірок:

FAM: = 100.00;

HEX: = 100.00

Rox = 0.00;

.

1. Ввести назви мішеней у блок параметрів Прив'язка каналів і співвіднести їх з каналами детекції. Для цього надрукувати назву мішені у вільне поле і натиснути клавішу Додати, при цьому нова мішень з'явиться в стовпці вже існуючих у пам'яті приладу мішеней. Назва мішені в стовпці Прив'язка каналів виділити курсором і натиснути відповідну їй кнопку каналу для детекції.

            HCV = FAM

10. У поле Довірчий інтервал установити значення 200%.

11. Натиснути кнопку Зберегти.

Проведення виміру флуоресцентного сигналу.

1. Включити прилад і запустити програму «Ala-1» на комп'ютері, приєднаному до приладу.

2. Задати протокол виміру. Для цього в головному меню вибрати «Протокол», «Створити новий» або «Відкрити», щоб відкрити створений раніше протокол.

3. У вікні протоколу необхідно вибрати тип використовуваного ротора (36х0,5 або 48х0,2), відзначити номер протоколу, вибрати в меню-вкладці назву тесту «HCV-FEP».

4. У колонку Зразок послідовно заповнити список детектируємих зразків у порядку постановки в ротор (проти часової стрілки).

5. Позначити зразки, що є фоновими для даної групи зразків, як «фон» (використовуючи сполучення клавіш «Ctrl» і «F»). Як зразки, позначених «ФОН» використовувати пробірки з контрольними зразками «ФОН».

6. Перевірити, щоб у колонку Тест напроти кожного зразка був зазначений відповідний тест («HCV-FEP»).

7. Закрити вікно редагування протоколу, натиснувши на кнопку Exit у верхньому лівому куті панелі. Протокол зберегти.

8. Установити пробірки в осередки ротора відповідно до заданої послідовності і запустити детекцію, вибравши в меню «Протокол», «Детекція» або значок детекція по протоколу в панелі інструментів (вгорі екрана).

ОБЛІК РЕЗУЛЬТАТІВ.

1. Отримані дані інтерпретуються автоматично за допомогою програми «Ala-1». Результати в таблиці представляються за допомогою наступних позначень: «виявлений» – позитивний результат;

«не виявлено» – негативний результат;

«сумнівно» – результат, який не можна однозначно інтерпретувати (сигнал по каналі, відведеному для детекції специфічної ДНК, перевищує порогове значення, припустиме для негативних зразків, але не перевищує порогове значення для позитивних зразків (сигнал у так названій «сірій зоні»);

«нд» – недостовірний результат (у зразку не детектується (не перевищує заданого порогового значення) ні специфічний сигнал, ні сигнал УКЗ).

2.                Результат вважається достовірним тільки у випадку проходження позитивних і негативних контролів ампліфікації і негативного контролю виділення ДНК (див. Таблицю).

Таблиця . Результати автоматичної інтерпретації аналізу контрольних точок «HCV-FEP».

Контролі	Контрольований етап ПЛР-аналізу	Результат по каналі Fam (HCV)	Результат по каналі HEX (BKЗ)
НК	Виділення РНК	HCV-не виявлено	ВКЗ+
ПКЗ	Виділення РНК	HCV-виявлено	ВКЗ+
ДО3	ПЛР	HCV-виявлено	ВКЗ-
У3	ПЛР	HCV-не виявлено	ВКЗ+

3.                Зразки, для яких отриманий результат «сумнівний», вимагають повторного проведення ПЛР і детекції.

4.                Зразки, для яких отриманий результат «нд» (крім К-), вимагають повторного проведення ПЛР і детекції. У випадку якщо повторно отриманий результат «нд», потрібно повторити аналіз зразка, починаючи з етапу виділення. Для зразка «K-» результат «нд» є нормою.

5.                Відсутність позитивного сигналу в пробі з позитивним контролем ПЛР може свідчити про неправильно обрану програму ампліфікації і про інші помилки, допущених на етапі постановки ПЛР. У такому випадку необхідно провести ПЛР ще раз.

6.                Якщо в негативному контролі (НК або К-) детектуєтся позитивний сигнал, виходить, відбулася контамінація реактивів або проб. У цьому випадку результати аналізу по всіх пробах вважаються недійсними. Потрібно повторити аналіз проб, а також ужити заходів по виявленню джерела контамінації.

7.                Якщо вимірювана частина пробірок забруднена флуоресціюючими агентами, значення флуоресценції в пробірках ФОН будуть перевищувати 200 одиниць. У цьому випадку необхідно протерти нижню частину пробірок 30-70% етанолом, висушити і повторити вимір.

 

Знезаражування.

Знезаражування біоматеріалу і реагентів варто проводити на кожній стадії окремо, вміщуючи одноразовий пластиковий посуд (пробірки, наконечники), колби-пастки вакуумних відсмоктувачів на 20 – 24 години в спеціальні контейнери, що містять дезинфікуючий 0,2% розчин ДП-2Т, 10%-ний розчин хлорного вапна, 5%-ний розчин хлораміну Б.

Умови і термін зберігання. Комплекти «РІБО-cорб-12» , «ЗТ-ПЛР-HCV-FEP» (крім DTT, ЗТ-ПЛР-суміш-1-FEP, ЗТ-ПЛР-суміш-2-FRT, ревертази і полімерази) зберігаються при температурі від 2 до 8 ⁰С. DTT, ЗТ-ПЛР-суміш-1-FEP, ЗТ-ПЛР-суміш-2-FRT, ревертазу і полімеразу з комплекту №2 зберігати і транспортувати при температурі мінус 18±2 ^оС.

Термін придатності - 6 місяців.