Биофарма-АмплиСенс-ПЦР-ВИЧ Монитор инструкция, аналоги и состав

Загальна характеристика. Тест-система «Біофарма-АмпліСенс-ПЛР-ВІЛ Монітор» призначена для кількісного визначення РНК вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ 1) у плазмі крові методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), сполученої зі зворотною транскрипцією РНК. Дану тест-систему можна використовувати після раніше підтвердженого діагнозу ВІЛ-інфекції методами ІФА та імуноблот. Тест-система розрахована на 12 постановок, включаючи контрольні зразки.

Принцип тестування: виділення тотальної РНК з плазми крові спільно з внутрішнім контрольним зразком; проведення реакції ампліфікації зі зворотною транскрипцією з наступною гібридизаційно-ферментною детекцією продуктів ПЛР на планшетах, частина лунок яких специфічно виявляє внутрішній контрольний зразок.

Склад. Тест-система складається з трьох комплектів реагентів:

«Рібо-сорб-12»

Комплект реагентів для виділення РНК з плазми крові;

«RT-PCR-ВІЛ»

Комплект реагентів для проведення зворотної транскрипції РНК ВІЛ 1 (метод ЗТ) і ампліфікації отриманої ДНК (метод ПЛР);

«ГіФА-96»

Комплект реагентів для гібридизаційно-ферментного аналізу ампліфікованої ДНК.

Форма випуску.

«Рібо-сорб-12» для виділення РНК з клінічного матеріалу:

*Реактив*	*Об'єм (мл)*	*Кількість*
Лізуючий розчин	5,8	1
Розчин для відмивання 1	8,0	1
Розчин для відмивання 3	15,0	1
Розчин для відмивання 4	8,0	1
Сорбент	0,4	1
РНК-елюент-ВІЛ	0,5	1
НКЗ (негативний контрольний зразок)	0,5	1
ПКЗ-1-ВІЛ (позитивний контрольний зразок 1)	0,01	1
ПКЗ-2-ВІЛ (позитивний контрольний зразок 2)	0,01	1
ВКЗ-ВІЛ (внутрішній контрольний зразок)	0,05	1

Комплект розрахований на виділення РНК з 12 проб, включаючи контрольні.

Комплект зберігати при температурі від 2 до 8⁰С. РНК-елюент-ВІЛ зберігати і транспортувати при мінус 18±2°С. Термін придатності набору – 6 місяців.

«RT-PCR-ВІЛ» для проведення зворотної транскрипції РНК ВІЛ 1 (метод ЗТ) і ампліфікації отриманої ДНК (метод ПЛР):

*Реактив*	*Об'єм (мл)*	*Кількість*
RT-PCR-mix	0,3	1
Ревертаза (AMV)	0,013	1
Полімераза (Taq)	0,013	1

Комплект розрахований на 12 реакцій.

Комплект зберігати при температурі від 2 до 8⁰С. Фермент AMV-ревертазу зберігати і транспортувати при мінус 18±2⁰С.

«ГіФА-96» для гібридизаційно-ферментного аналізу ампліфікованої ДНК:

*Реактив*	*Об'єм (мл)*	*Кількість*
Денатуруючий розчин	1,0	1
Гібридизаційний буфер (ГБ)	10,0	1
Кон'югатний буфер (КБ)	10,0	1
Кон'югат	0,12	1
Відмиваючий буфер (ВБ), п'ятикратний	100,0	2
Субстрат ТМБ	10,0	1
Зупиняючий розчин	10,0	1
Планшет, сенсибілізований ДНК-зондами до ВІЛ і ВКЗ		1 шт

Комплект розрахований на проведення 12 кількісних визначень, включаючи контролі.

Комплект зберігати при температурі від 2 до 8⁰С. Планшет, сенсибілізований зондами, зберігати при мінус 18±2⁰С. Транспортування планшету проводиться протягом доби при температурі від 2 до 8ºС.

Матеріали й устаткування.

Для виділення РНК з клінічного матеріалу – ЗОНА 1:

- стерильна ламінарна шафа («БОВ-001-АМС», м. Міасс, Росія або аналог);

- твердотільний термостат для пробірок типу «епендорф» на 25–100^ос (наприклад, «ТЕРМО-24», фірми «Біоком», Росія або аналог);

- мікроцентрифуга для пробірок типу «епендорф» до 12 тис. g («Elmi», Латвія, «Hettish», “Mini-Spin”, Eppendorf, Німеччина або аналог);

- центрифуга/вортекс («Micro-Spin», «Minigen», Німеччина, «ТЭТА-2», фірми «Біоком», Росія або аналог);

- окремий набір автоматичних піпеток перемінного об'єму (наприклад, «Ленпіпет» або аналог);

- одноразові поліпропіленові пробірки, що загвинчуються або щільно закриваються кришками на 1,5 мл (наприклад, «Axygen», США або аналог);

- одноразові наконечники для піпеток перемінного об'єму з аерозольним бар'єром до 200 і до 1000 мкл (наприклад, фірми «QSP», США або аналог);

- одноразові наконечники для піпеток перемінного об'єму до 200 мкл (наприклад, «Ленпіпет», Росія, «QSP», США або аналог);

- штативи для наконечників, мікропробірок на 1,5 мл («Ленпіпет», «Хелікон» або аналог);

- холодильник на 2–8 ^оС і на мінус 20 ^оС;

- ємність з дезинфікуючим розчином;

- одноразовий халат і одноразові гумові рукавички.

Для проведення зворотної транскрипції й ампліфікації (ПЛР) – ЗОНА 2:

- настільний бокс з бактерицидною лампою (наприклад, «Циклотемп», фірми СП «РТС», Росія або аналог) або стерильна ламінарна шафа («БОВ-001-АМС», м. Міасс, Росія або аналог);

- ампліфікатори «GeneAmp PCR System 2400», «GeneAmp PCR System 2700», фірми «Applied Biosystems», США; «Palm Cycler» фірми «Сorbett Research», Австралія або аналог;

- одноразові поліпропіленові пробірки для ампліфікації на 0,2 мл (наприклад, «QSP», «Axygen”, США або аналог);

- одноразові наконечники для піпеток перемінного об'єму з аерозольним бар'єром до 100 мкл, вільні від РНКаз (наприклад, «QSP», США або аналог);

- окремий набір автоматичних піпеток перемінного об'єму (наприклад, «Ленпіпет», Росія або аналог);

- штативи для наконечників, мікропробірок на 0,2 мол (наприклад, «Ленпіпет», «Хелікон», Росія або аналог);

- холодильник на плюс 4 ^оС і на мінус 20 ^оС для збереження реактивів і РНК;

- ємність для скидання наконечників;

- комплект засобів для обробки робочого місця;

- одноразовий халат і одноразові гумові рукавички.

Для гібридизаціонно-ферментного аналізу ампліфіцированої ДНК – ЗОНА 3:

- холодильник на 2–8 ⁰С з морозильною камерою на мінус 20 ⁰С;

- термостат плашечний на 37 ⁰С (наприклад, iEMS, “Labsystem”, Фінляндія або аналог);

- окремий халат і одноразові гумові рукавички;

- мірний циліндр на 1 літр;

- окремий набір одноканальних автоматичних піпеток перемінного об'єму (наприклад, «Ленпіпет», Росія або аналог);

- окремий набір восьмиканальних автоматичних піпеток перемінного об'єму (наприклад, «Ленпіпет», Росія або аналог);

- плашечний спектрофотометр (наприклад, "Мультіскан", "Уніскан", Латвія або аналог);

- вошер (не обов'язково);

- наконечники для автоматичних піпеток (наприклад, «Ленпіпет», Росія або аналог).

Підготовка до аналізу.

Збирання і збереження зразків.

Матеріалом для дослідження служить плазма крові.

Одержання плазми крові.

Збирання крові проводиться натще з ліктьової вени одноразовою голкою (діаметр 0,8–1,1 мм) в одноразову пластикову пробірку з антикоагулянтом (3% розчин ЕДТА в співвідношенні 1:20) або спеціальну вакуумну систему типу «Venoject» (з ЕДТА), «Vacuett^®». Гепарин як антикоагулянт використовувати не можна! Пробірка закривається кришкою і перевертається кілька разів (для перемішування з антикоагулянтом). Плазму крові одержують центрифугуванням цільної крові (800–1600 g протягом 20 хв). Потім відбирають плазму окремими наконечниками з аерозольним бар'єром у стерильні пробірки типу «Епендорф» на 1,5 мл. Для виділення РНК використовується 100 мкл зразка плазми.

Зберігати плазму крові можна не більше 3 діб при температурі від 2 до 8°С, протягом 1 року – при температурі мінус 70 °С.

Допускається тільки одноразове заморожування-відтаювання матеріалу. При заморожуванні клінічного матеріалу його транспортування повинне проводитися в замороженому стані.

Запобіжні заходи.

Необхідне суворе дотримання правил облаштування, техніки безпеки, виробничої санітарії, протиепідемічного режиму й особистої гігієни при роботі в лабораторіях (відділеннях, відділах) санітарно-епідеміологічних установ.

Працюють тільки в одноразових рукавичках, використовують і змінюють при кожній операції одноразові наконечники для автоматичних піпеток з аерозольним бар'єром. Одноразовий пластиковий посуд (пробірки, наконечники) повинен скидатися в спеціальний контейнер, що містить дезинфікуючий 0,2% розчин ДП-2Т, 10%-ний розчин хлорного вапна, 5%-ний розчин хлораміну Б або 1 N розчин соляної кислоти.

Аналіз проводиться в три етапи в трьох окремих приміщеннях (зонах).

Усе лабораторне устаткування, у тому числі піпетки, штативи, лабораторний посуд, а також усі робочі розчини повинні бути виключно стаціонарними. Забороняється їх перенос з одного приміщення в інше. Переміщення персоналу з кімнати для детекції продуктів ПЛР в інші приміщення заборонено.

Поверхні столів, а також приміщення, у яких проводиться постановка ПЛР, повинні обов'язково до початку і після початку робіт опромінюватися ультрафіолетовим світлом.

Проведення аналізу.

ЕТАП 1. Виділення РНК з клінічних проб

Проводиться в ЗОНІ-1 – кімнаті для обробки клінічного матеріалу.

Порядок роботи.

Лізуючий розчин прогріти при температурі від 60 до 65 ^оС до повного розчинення кристалів. Дати охолонути розчину до кімнатної температури.
Для виділення РНК із 12 проб, включаючи контролі, у баночку з лізуючим розчином додати стерильним наконечником з бар'єром 50 мкл внутрішнього контрольного зразка (ВКЗ). Баночку ретельно перемішати.

Увага! Суміш лізуючого розчину з ВКЗ зберігається не більш 2 годин.

Лізис клінічного матеріалу. Узяти пробірки на 1,5 мл, які щільно закриваються кришкою, для обробки необхідної кількості проб і контролів, промаркувати. При проведенні аналізу необхідно поставити один негативний контроль і два позитивних контролі (ПКЗ-1) і (ПКЗ-2). У кожну пробірку окремим наконечником додати 450 мкл підготовленої суміші лізуючого розчину з ВКЗ.
У кожну пробірку додати по 0,1 мл досліджуваної плазми, закрутити кришку і перемішати на вортексі. Осадити на центрифузі для скидання крапель рідини з кришки.
Підготовка негативного контролю етапу виділення РНК (НК). У пробірку з лізуючим розчином додати 0,1 мл негативного контрольного зразку (НКЗ), перемішати на вортексі й осадити краплі рідини з кришки.
Підготовка першого позитивного контролю етапу виділення РНК (ПКЗ-1). У пробірку з лізуючим розчином додати 0,09 мл НКЗ і 10 мкл позитивного контрольного зразка 1 (ПКЗ-1), перемішати на вортексі й осадити краплі рідини з кришки.
Підготовка другого позитивного контролю етапу виділення РНК (ПКЗ-2). У пробірку з лізуючим розчином додати 0,09 мл НКЗ і 10 мкл позитивного контрольного зразка 2 (ПКЗ-2), перемішати на вортексі і осадити краплі рідини з кришки.
Ретельно ресуспендувати сорбент на вортексі. У кожну пробірку окремим наконечником додати по 25 мкл ресуспендованного сорбенту. Перемішати на вортексі, залишити на 10 хв при кімнатній температурі, ретельно перемішуючи кожні 2 хв.
Процентрифугувати пробірки для осадження сорбенту при 10 тис. g протягом 30 сек на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний відсмоктувач і окремий наконечник для кожної проби.
Додати в пробірки по 0,5 мл розчину для відмивання 1. Перемішати на вортексі до повного ресуспендування сорбенту. Центрифугувати пробірки на мікроцентрифузі при 10.000 g протягом 30 сек. Відібрати надосадову рідину з кожної пробірки окремим наконечником, використовуючи вакуумний відсмоктувач.
Додати в пробірки по 0,5 мл розчину для відмивання 3. Перемішати на вортексі до повного ресуспендування сорбенту. Центрифугувати пробірки на мікроцентрифузі при 10.000 g протягом 30 сек. Відібрати розчин для відмивання 3 з кожної пробірки окремим наконечником, використовуючи вакуумний відсмоктувач.
Повторити відмивання розчином для відмивання 3.
Додати в пробірки по 0,5 мл розчину для відмивання 4. Перемішати на вортексі до повного ресуспендування сорбенту. Центрифугувати пробірки на мікроцентрифузі при 10.000 g протягом 30 сек. Цілком відібрати розчин для відмивання 4 з кожної пробірки окремим наконечником, використовуючи вакуумний відсмоктувач.
Висушити сорбент, помістивши пробірки в термостат на 56⁰С на 10 хв з відкритими кришками.
Ресуспендувати сорбент у 40 мкл РНК-елюенту-ВІЛ. Прогріти в термостаті при 65⁰С 5 хвилин, перемішати на вортексі й осадити сорбент на центрифузі при 10.000 g протягом 2 хвилин.

РНК-проби готові до постановки полімеразної ланцюгової реакції зі зворотною транскрипцією.

Реакцію зворотної транскрипції варто проводити відразу після одержання РНК-проби. Відбирати розчин РНК для реакції потрібно дуже обережно, не захоплюючи сорбент. Якщо сорбент скаламутився, необхідно осадити його на центрифузі.

ЕТАП 2. Постановка полімеразної ланцюгової реакції зі зворотною транскрипцією

Проводиться в ЗОНІ 2 – кімнаті для розкапування реагентів і проведення ПЛР-ампліфікації. Загальний об'єм реакційної суміші – 50 мкл, об'єм РНК-проби – 25 мкл.

Порядок роботи:

Увага! При роботі з РНК необхідно використовувати тільки одноразові стерильні пластикові видаткові матеріали, що мають спеціальне маркірування «RNase-free», «DNase-free».

Відібрати необхідну кількість мікропробірок на 0,2 мл.
Фермент AMV-ревертазу перемішати і відкрутити на вортексі, щоб осадити краплі з кришки і стінок пробірки.
Приготувати реакційну суміш на 12 реакцій: у пробірку з 2-кратним реакційним буфером (RT-PCR-mix) додати 13 мкл ферменту ревертази AMV (10 од/мкл) і 13 мкл Taq-полімерази (5 од/мкл), ретельно перемішати.
Внести в мікропробірки по 25 мкл готової реакційної суміші.
Використовуючи наконечник з бар'єром, додати 25 мкл готової РНК-проби в пробірку з реакційною сумішшю, обережно перемішати піпетуванням.
Поставити пробірки в ампліфікатор GeneAmp PCR System, закрити кришку ампліфікатора (При додаванні РНК-проб необхідно уникати попадання сорбенту в реакційну суміш для ПЛР).
Запустити на ампліфікаторі нижчезазначену програму:

	Ампліфікатори з активним регулюванням (по розчину в пробірці): “*GeneAmp PCR System 2700”, (Perkin Elmer)*			Ампліфікаторі з активним регулюванням (по розчину в пробірці): “*GeneAmp PCR System 2400”, (Perkin Elmer), Palm Cycler (Сorbett Research)*
цикл	температура	час	цикли	температура	час	цикли
1	42 ⁰С	30 хв	1	42 ⁰С	30 хв	1
2	95 ⁰С	2 хв	1	95 ⁰С	2 хв	1
3	95 ⁰С	40 сек	5	95 ⁰С	20 сек	5
	52 ⁰С	40 сек		52 ⁰С	20 сек
	72 ⁰С	40 сек		72 ⁰С	20 сек
4	95 ⁰С	40 сек	21	95 ⁰С	20 сек	21
	55 ⁰С	40 сек		55 ⁰С	20 сек
	72 ⁰С	40 сек		72 ⁰С	20 сек
5	72 ⁰С	1 хв	1	72 ⁰С	1 хв	1
6	10 ⁰С	збереження		10 ⁰С	збереження

Після закінчення реакції зібрати пробірки в спеціальний штатив і відправити в кімнату для аналізу продуктів ПЛР (ЗОНУ 3). Допускається збереження ампліконів при температурі від 2^оС до 8 ^оС не більш 2-х днів. Аналіз продуктів ампліфікації проводиться гібридизаційно-ферментним методом.

ЕТАП 3. Гібридизаційно-ферментний аналіз ампліфікованої ДНК

Проводиться в ЗОНІ 3 – кімнаті для аналізу продуктів ампліфікації.

Робота з ампліфікованими ДНК повинна проводитися в окремій кімнаті співробітниками лабораторії, що не проводять маніпуляцій у зоні 1 і зоні 2.

Підготовка реагентів для гібридизації на плашках:

Готують однократний відмиваючий розчин, для цього до 200 мл п'ятикратного відмиваючого буфера додають 800 мл стерильної деіонізованої води, зберігають при кімнатній температурі протягом 1 дня.
Кон'югат розводять буфером для кон'югату (кон'югатний буфер) безпосередньо перед використанням або не більш ніж за 2 години, для цього в баночку з кон'югатним буфером додають 110 мкл кон'югату і ретельно перемішують.

Увага! При розкапуванні гібридизаційного і кон'югатного буфера, ТМБ і зупиняючий розчин у лунки планшета необхідно їх додавати безпосередньо на дно лунки, не торкаючись наконечником її стінок.

Порядок роботи:

У пробірки з ампліфікованими пробами розкапати по 50 мкл денатуруючого розчину і перемішати піпетуванням, залишити на 10 хв при кімнатній температурі.
Гібридизаційний буфер розкапати у лунки планшета з імобілізованими зондами по 100 мкл, накрити планшет кришкою або заклеїти захисною плівкою. Прогріти 10 хв при температурі 37 ⁰С у термостаті для планшетів.
Додати в лунки ряду А планшета з прогрітим гібридизаційним буфером по 25 мкл денатурованих проб за допомогою багатоканальної піпетки, перемішати піпетуванням 15 разів і зробити п'ятикратну титровку до ряду F, піпетуючи в кожному ряді не менш 10 разів. Після піпетування в лунках ряду F 25 мкл видаляють. Потім у лунки ряду G додати по 25 мкл денатурованих проб і зробити п'ятикратну титровку в лунки ряду H. З ряду H 25 мкл видаляють. Накрити планшет кришкою або захисною плівкою і поставити при температурі 37 ⁰С у термостат для планшетів на 1 годину. (Лунки планшета рядів A-F покриті зондом, специфічним ВІЛ; лунки рядів G-H покриті зондом, специфічним ВКЗ).
Видалити гібридизаційний буфер з лунок і промити 5 разів однократним відмиваючим розчином, заливаючи його в кожну лунку по 200 мкл, щораз ретельно видаляючи його залишки.
Додати в лунки по 100 мкл розведеного кон'югату, накрити планшет кришкою або захисною плівкою і поставити при температурі 37 ⁰С у термостат для планшетів на 20 хв.
Видалити кон'югат з лунок і промити 5 разів однократним відмиваючим розчином, заливаючи його в кожну лунку по 200 мкл, щораз ретельно видаляючи його залишки.
Додати в лунки по 100 мкл субстрату ТМБ. Поставити в темне місце на 10 хвилин.

Увага! ТМБ варто наносити безпосередньо на дно лунки, не торкаючись наконечником її стінок.

Реакцію зупиняють, додавши в лунки по 100 мкл зупиняючого розчину.
Облік результатів роблять спектрофотометрично при довжині хвилі 450 нм безпосередньо в планшетах на фотометрах типу "Мультіскан", "Уніскан" і т. п.

Облік результатів.

Для кожного з досліджуваних і контрольних зразків концентрацію РНК ВІЛ розраховують у такий спосіб:

Вибирають лунки, покриті зондом, специфічним для ВІЛ (ряди від А до F), у яких оптичний сигнал має мінімальне значення в діапазоні 0,35 – 2,0 ОО.
Розраховують загальну оптичну щільність для ВІЛ-амплікона, множачи обране значення на відповідний фактор розведення (1, 5, 25, 125, 625, 3125):

Ряд	Фактор розведення
А	1
У	5
З	25
D	125
E	625
F	3125

Вибирають лунки, покриті зондом, специфічним для ВКЗ (ряди G і H), у яких оптичний сигнал має мінімальне значення в діапазоні 0,35 – 2,0 ОО.
Розраховують загальну оптичну щільність для ВКЗ, множачи обране значення на відповідний фактор розведення (1, 5):

Ряд

Фактор

розведення

Для розрахунку концентрації РНК ВІЛ у плазмі крові для кожного з досліджуваних і контрольних зразків загальну оптичну щільність ВІЛ ділять на загальну оптичну щільність внутрішнього контрольного зразка і множать на коефіцієнт, представлений на окремому вкладиші:

Загальна оптична щільність ВІЛ

----------------------------------------------------- Х коефіцієнт = копії РНК ВІЛ/мл.

Загальна оптична щільність внутрішнього стандарту

Коефіцієнт, представлений на вкладиші (число копій РНК ВКЗ/мл плазми), специфічний для кожного лота.

Лінійний діапазон виміру тест-системи: 500–800.000 копій РНК/мл. Якщо результат більше ніж 800.000 копій/мл, то він видається як результат більше 800.000 копій/мл.

Якщо результат менше ніж 500 копій/мол, то він видається як результат менше 500 копій/мл.

При одержанні значення вище 800.000 копій/мл зразок може бути перетестований після десятикратного розведення негативною плазмою; отриманий результат множать на 10.

При одержанні значення менше 500 копій/мл зразок плазми може бути перетестований після попереднього центрифугування в такому режимі: 1,0 мл плазми крові центрифугують при 25.000 g або більш протягом 1 години при температурі від 2^оС до 8 ⁰С, акуратно відбирають 900 мкл супернатанту, далі аналіз проводять за вищеописаною схемою, а отриманий результат ділять на 10.

Результати аналізу не підлягають обліку в таких випадках:

- Відсутність закономірного зниження оптичного сигналу в процесі титрування амплікона: потрібна перестановка даної проби.

- Оптичний сигнал для внутрішнього контрольного зразка в п'ятикратному розведенні нижче 0,35 ОО: потрібна перестановка даної проби.

- Оптичний сигнал для негативного контрольного зразка вище 0,35 ОО: потрібна перестановка всієї панелі.

- Результати за позитивними контрольними зразками повинні вкладатися в діапазон, зазначений на вкладиші. Якщо отримані значення не вкладаються в заданий діапазон, потрібна перестановка всієї панелі.

Знезаражування.

Знезаражування біоматеріалу і реагентів варто проводити на кожній стадії окремо, поміщаючи одноразовий пластиковий посуд (пробірки, наконечники), колби-пастки вакуумних відсмоктувачів на 20 – 24 години в спеціальні контейнери, що містять дезинфікуючий 0,2% розчин ДП-2Т, 10%-ний розчин хлорного вапна, 5%-ний розчин хлораміну Б або 1 N розчин соляної кислоти.

Умови і терміни зберіння. Комплекти «РІБО-сорб-12» (крім РНК-елюента-ВІЛ), «RT-PCR-ВІЛ» (крім AMV-ревертази) і «ГіФА-96» (крім планшета) зберігаються при температурі від 2 до 8 ⁰С. РНК-елюент-ВІЛ, ревертаза і планшет зберігаються при температурі мінус 18±2⁰С.

Термін придатності – 6 місяців.