Изучение противовирусных свойств препарата Гексорал® in vitro в отношении ряда вирусов, вызывающих острые респираторные инфекции и герпес

До сих пор актуальным является поиск средств, активно подавляющих репликацию возбудителей вирусных инфекций, вызывающих острые респираторные заболевания [1, 5, 7, 8, 9,] среди которых пандемический вирус гриппа А/H1N1pdm [5], с которым в большей степени связаны летальные случаи гриппа у людей, высоковирулентный вирус гриппа А птиц/H5N1 [1, 4], по данным ВОЗ, вызывающий 60% летальность при заражении людей, респираторно-синцитиальный вирус (РСВ), являющийся одной из основных причин острых респираторных заболеваний и, наконец, вирус герпеса простого I-го типа семейства Herpesviridae [6, 10], один из представителей которого - вирус Эпштейн-Барр является возбудителем инфекционного мононуклеоза у детей.

В Государственной коллекции вирусов (ГКВ), действующей на базе ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России, собрана коллекция всех упомянутых штаммов вирусов, пригодных для скрининга противовирусной активности препаратов.

Целью настоящей работы явилось изучение способности препаратов Гексорал^® в виде раствора для местного применения 0,1% и аэрозоля для местного применения 0,2% , а также субстанции Гексэтидин, входящей в состав этих препаратов, подавлять in vitro инфекционную активность вирусов, поражающих респираторный тракт человека, а также вируса герпеса.

Методика исследований.

Препараты. Субстанция Гексэтидин (1,3-бис (2 этилгексил) гексагидро-5-метил-5—пиридиминамин № 1221Б номер партии 4Е1399, с сертификатом качества Orleans FRANCE, была любезно предоставлена компанией Джонсон и Джонсон, также как и препараты Гексорал^® (Hexoral^®) в виде раствора для местного применения 0,1%, производитель «MeNeilManufacturing», Франция. Содержание гексэтидина (1,3-бис-(2 – этилгексил)-амино-5-метил- гексагидропиримидин) – 0,1 г/100 мл раствора., Гексорал^® (Hexoral^®) в виде аэрозоля для местного применения 0,2% , производитель «Famar Orleans», Франция. Содержание гексэтидина – 0,2 г/100 мл раствора. Ацикловир в виде субстанции (ациклогуанозин, АЦГ, 9-гидроксиэтоксиметилгуанин) производства Glaxo-SmithKline (Великобритания) использовали в качестве референс-препарата.

Культуры клеток. Для оценки цитотоксических свойств и антивирусной активности субстанции гексэтидин и препаратов Гексорал^® в виде раствора и аэрозоля, содержащих 0,1% и 0,2% гексэтидина соответственно, использовали культуры перевиваемых линий клеток Vero–Е6 – линию клеток почки эмбриона зеленой мартышки. Культуры клеток выращивали до полного монослоя в 96-луночных пластиковых панелях с использованием ростовой среды Игла МЭМ (предприятие «ПанЭко», Москва), соединённой с предварительно прогретой на водяной бане при 56°С в течение 20 мин 7 % эмбриональной телячьей сывороткой (предприятие «ПанЭко», Москва) при 37°С в атмосфере 4% СО2 с добавлением глютамина (150 мкг/мл) и антибиотиков (100 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина). Средой поддержки после адсорбции вируса служила: среда Игла МЭМ, содержащая глютамин и антибиотики в той же концентрации и 1% сыворотки эмбриона телят (Sigma, США). Культуры клеток почек собаки – MDCK выращивали в 96-луночных пластиковых панелях с использованием ростовой среды и среды поддержки того же состава с добавлением в среду-поддержки 2 мкг/мл ТРСК-трипсина (Т-tosil –L – Phenilalanilchloromethylketone, Sigma). Культуры клеток почки эмбриона свиньи - СПЭВ также в 96-луночных пластиковых панелях с использованием ростовой среды 199 (предприятие «ПанЭко», Москва) с добавлением 100 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина и 10% гретой сыворотки крупного рогатого скота. Линии клеток получены из коллекции клеточных культур ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И Ивановского» Минздрава России.

Вирусы. В исследованиях использовали: 1) штамм вируса гриппа A/duck/Novosibirsk/56/05 (H5N1), изолированный в 2005 г в Новосибирской области от домашних птиц и депонированный в ГКВ [7]. 2) пандемический вирус гриппа А/Москва/01/2009 (H1N1)pdm, изолированный в 2009 г в г. Москве и депонированный в ГКВ. 3) Респираторно-синицитиальный вирус (РСВ), штамм Long, получен из ГКВ. 4) Вирус герпеса простого типа 1 штамм L₂ (ВПГ-1/ L₂) получен из ГКВ. Во всех случаях в качестве вируссодержащего материала использовали культуральную жидкость, собранную из зараженных каждым из этих вирусов культур клеток на высоте развития инфекции клеток.

Для изучения цитотоксической активности препаратов Гексорал^® в виде раствора и аэрозоля и субстанции Гексэтидин использовали культуры клеток Vero-Е6, СПЭВ и MDCK. Клеточную суспензию в ростовой среде (концентрация клеток – 4*10⁵ клеток в мл) вносили в 96-луночные пластиковые панели, и после 24-часовой инкубации в термостате при температуре 37°C монослой клеток дважды отмывали раствором Хенкса и добавляли различные концентрации препаратов в среду-поддержки, при этом общий объем жидкости в лунке составлял 200 мкл. Обработанные и необработанные таким образом культуры клеток инкубировали в течение 72 часов, после чего клетки, окрашенные метиленовым синим, подсчитывали, используя слайдный цитометр (Cauntess) фирмы Invitrogen. Рассчитывали цитотоксическую дозу 50 (CD50), которая соответствовала минимальной концентрации препарата, приводящей к гибели 50% клеток монослоя к 72 часам после их контакта препаратом.

Противовирусную активность препаратов Гексорал^® изучали согласно известной методике доклинических испытаний препаратов [4], С целью изучения способности препаратов Гексорал^® в виде раствора и аэрозоля и субстанции гексэтидин инактивировать инфекционные свойства вирусов вируссодержащую жидкость с исходным титром соединяли с исследуемыми препаратами (опыт) или со средой поддержки (контроль) в соотношении 1:1 и интенсивно встряхивали в течение 30 или 60 секунд при комнатной температуре. После этого смеси немедленно разводили, делая последовательные десятикратные серийные разведения, и по 100 мкл каждого разведения вносили на отмытый монослой чувствительных для данного вируса клеток. Через 72-96 часов инкубации, когда в контрольных (не обработанных препаратами) лунках развивалась полная деструкция монослоя, методом Рида и Менча определяли инфекционный титр вируса. По разнице инфекционных титров вируса в контрольных и опытных вариантах судили о противовирусном действии гексэтидина, в том числе, и в составе препаратов, а именно, насколько снижается инфекционный титр вируса в материале, обработанном препаратами, в сравнении с титрами контрольного вирусного материала.

Статистическую обработку данных проводили общепринятыми методами для биологических исследований, предложенными Бейли Н. 1963, Лакин Г.Ф. 1990, а также с помощью метода Спирмана-Кербера с оценкой достоверности отличий (P=0,05) для 95% доверительного уровня.

Результаты исследования. Активным компонентом препарата Гексорал^® (Hexoral^®) производства «MeNeilManufacturing» (Франция) является гексэтидин, обладающий широким спектром антибактериального и противогрибкового действия, в частности, в отношении грамположительных бактерий и грибов рода Candida, Pseudomonas aeruginosa, Proteus. Гексэтидин способствует разрушению оболочки, а также подавляет окислительные реакции метаболизма бактерий (антагонист тиамина). В концентрации 100 мкг/мл гексэтидин активно подавляет рост большинства штаммов бактерий. Развитие устойчивости не наблюдалось. В то же время нет достаточной информации о противовирусном действии препарата гексэтидина в отношении ряда возбудителей вирусных инфекций, поражающих респираторный тракт человека.

В результате проведенных исследований по изучению противовирусной (вирулицидной) активности гексэтидина in vitro в виде субстанции или в виде коммерческого раствора для наружного применения Гексорал^® было показано, что гексэтидин характеризуется цитотоксическими свойствами для культур клеток различного происхождения (СПЭВ, Vero-E6, MDCK). При этом, CD50 гексэтидина, в виде субстанции и в составе 0,1% раствора Гексорал^® для культур клеток Vero-E6, MDCK и СПЭВ была одинаковой и составила 5,0 мкг/мл. CD50 аэрозоля Гексорал^® для данного вида клеточных линий составила 10,0 мкг/мл. (табл. 1)

Табл. 1. Результаты исследования цитотоксических свойств препаратов Гексорал, содержащих 0,1 и 0,2% гексэтидина и субстанции гексэтидин.

Культуры клеток, используемые для изучения цитотоксических свойств	Препараты, содержащие  гексэтидин (мкг/мл)
	CD50 0,1% раствора Гексорал®	CD50 0,2% аэрозоля Гексорал®	CD50  субстанции гексэтидин
Vero (V)	1:2001) (5,0  мкг/мл)	1:200 (10,0 мкг/мл)	5 мкг/мл
MDCK	1:200 (5,0 мкг/мл)	1:200 (10,0 мкг/мл)	5 мкг/мл
СПЭВ	1:200 (5,0  мкг/мл)	1:200 (10,0  мкг/мл)	5 мкг/мл

Примечание 1) разведения препаратов, содержащих гексэтидин, соответствующие CD50.

Обнаружено, что не цитотоксические концентрации гексэтидина характеризовались способностью инактивировать инфекционные свойства вирусов, поражающих респираторный тракт: высоко патогенные вирусы гриппа А/H5N1, пандемический вирус гриппа А/H1N1pdm, РСВ и вирус ВПГ-1/ L₂.(табл. 2-4)

Табл. 2. Способность гексэтидина в виде 0,1% раствора и 0,2% аэрозоля Гексорал^® и в виде субстанции снижать инфекционную активность вирусов гриппа A/H5N1 и А/H1N1pdm для культур клеток Vero-Е6 и MDCK соответственно.

Препараты	Время (сек)	Титры вируса гриппа A/H5N1 и А/H1N1pdm (lgТЦИД50)после обработки препаратами в концентрациях (мкг/ мл):
		5,0		2,5		Вирус без препарата
		A/H5N1	А/H1N1 pdm	A/H5N1	А/H1N1 pdm	A/H5N1	А/H1N1 pdm
Гексорал® (раствор)	30	2,5±0,3	1,3±0,2	2,3±0,1	1,5±0,2	4,2±0,1	3,5±0,2
	60	2,4±0,2	1,2±0,3	2,1±0,4	1,4±0,3	4,2±0,1	3,6±0,2
Гексорал® (аэрозоль)	30	2,0±0,2	1,1±0,3	2,2±0,4	1,3±0,2	4,2±0,1	3,5±0,2
	60	2,0±0,1	1,0±0,1	2,3±0,1	1,2±0,4	4,2±0,1	3,6±0,2
Гексэтидин	30	2,1±0,3	1,0±0,2	2,7±0,2	1,2±0,2	4,2±0,1	3,5±0,2
	60	2,2±0,1	1,0±0,1	2,3±0,2	1,3±0,1	4,2±0,1	3,4±0,2

Табл. 3. Способность гексэтидина в виде 0,1% раствора, 0,2% аэрозоля Гексорал^® и в виде субстанции снижать инфекционную активность РС-вируса для культур клеток Vero-E6.

Препараты	Время (сек)	Титры РС вируса после обработки препаратами в концентрациях (мкг/мл)		РС-вирус без препарата (контроль)
		5,0	2,5
Гексорал® (раствор)	30	4,0±0,05	4,2±0,1	6,3±0,1
	60	3,9±0,1	4,0±0, 2	6,3±0,1
Гексорал® (аэрозоль)	30	3,2±0,2	4,0±0,1	6,2±0,1
	60	3,1±0,1	3,9±0, 3	6,1±0,1
Гексэтидин	30	4,1±0,3	3,8±0,05	6,3±0,1
	60	4,2±0,1	4,1±0,2	6,3±0,1

Таблица 4. Изучение вирулицидного эффекта препарата Гексорал^® (раствор для местного применения) и субстанции гексэтидин на модели вируса герпеса простого типа 1.

Условия опыта	Титр вируса ***		Cредний титр вируса по результатам двух опытов		Уменьшение титра вируса относительно контроля
	lg БОЕ/мл		lg БОЕ/мл		в абсолютном выражении		%
Контроль*	6,70 6,51 6,44 6,88		6,63 ± 0,10		-		-
30-секундная экспозиция**	а)	б)	а)	б)	а)	б)	а)	б)
	4,87 4,51 4,48 4,70	6,44 6,70 6,40 6,40	4,64 ±0,09	6,49 ± 0,07	1,99	-	98,99	-
60-секундная экспозиция**	4,40 4,00 4,24 4,10	4,65 4,70 4,68 4,88	4,19 ± 0,09	4,73 ±0,05	2,44	1,76	99,65	98,29
Примечание:  а  -  в присутствии препарата Гексорал® ,  б – в присутствии субстанции гексэтидин *** .    Приведены результаты двух независимых опытов.

Вирулицидные свойства субстанции гексэтидин, а также аэрозоля и раствора Гексорал^® проявляются в течение короткого времени экспозиции препаратов с материалом, содержащим вирусы, вызывающие заболевания респираторного тракта, и вирус герпеса (в течение 30 секунд). В сравнительных исследованиях по изучению противовирусной активности субстанции гексэтидин и препаратов Гексорал^® в отношении вирусов гриппа, РСВ и ВПГ-1/L₂ показано, что вирулицидные свойства гексэтидина в составе раствора и аэрозоля Гексорал^® не отличаются от вирулицидых свойств субстанции. Их вирулицидные свойства проявляются стабильно и характеризуются высокой активностью, а именно, в нетоксических концентрациях способностью в 100 и более раз подавлять инфекционную активность вирусов (табл.2–4).

Показана одинаковая способность субстанции гексэтидин и препаратов Гексорал^® инактивировать инфекционную активность всех изучаемых в данной работе вирусов. Препараты не влияют на внутриклеточную репродукцию вируса в клетке.

Получены данные о том, что вирулицидный эффект препаратов Гексорал^® обусловлен действием гексэтидина.

Снижение концентрации исследованных инфекционных вирусов от начального уровня (титра) после воздействия препаратов, содержащих гексэтидин, составляло 99 и более процентов - при использовании препаратов в концентрации 2,5 мкг/мл и выше, и более 90% - при использовании препаратов в концентрации 1,25 мкг/мл;

Сведения

об авторах статьи «Изучение противовирусных свойств препарата Гексорал^® in vitro в отношении ряда вирусов, вызывающих острые респираторные инфекции и герпес»

1. Дерябин Петр Григорьевич, доктор медицинских наук, профессор, зам. директора ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России, 123098 Москва, ул. Гамалеи, 16, тел. 499-190-28-32
2. Галегов Георгий Артемьевич, доктор медицинских наук, профессор, руководитель лаборатории химиотерапии вирусных инфекций ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского» Минздрава России, 123098 Москва, ул. Гамалеи, 16, тел. 499- 190-28-13

Литература:

1. Дерябин П.Г., Галегов Г.А., Ботиков А.Г., Бурцева Е.И. и др. Вопр. Вирусол., 2011 г., №1, стр. 21-24
2. Львов Д.К. Федякина И.Т, Щелканов М.Ю. и др., Вопр. вирусол. 2006, №2, С. 20- 22.
3. Львов Д.К., Щелканов М.Ю., П.Г.Дерябин и др. Вопр. вирусол., 2006, №1, С. 11-14.
4. Миронов А.Н., Бунатян Н.Д. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств.2012, Издательство Гриф и К, 944 стр.
5. Федякина И.Т., Щелканов М.Ю., Дерябин П.Г. Антибиотики и химиотерапия, 2011, том 56, № 3-4, стр.3 – 9.
6. De Clercq E., Descamps J., Verheist. G., Walker RT, Jones AS, Torrence PF, Shugar D. J. Infect. Dis., 1980, V.141, №5. - P. 563-573.
7. Dolin R., Reichman R.C., Madore H.P. et al. N. Engl. J. Med. – 1982. – Vol.307. – P. 580-584.
8. Fedorov II, Kazmina EM, Gurskaya GV, Jasko MV, Zavodnic VE, Balzarini J, DeClercq E, Faraj A, Sommadossi JP, Imbach JL, Gosselin G . J. Med. Chem. – 1997. – Vol. 40, № 4. - P. 486-494]
9. Hayden F.G., Atmar R.L., Schelling M. et al. N. Engl. J. Med. – 1999. – Vol. 341. – P. 1336-1343.
10. Sarisky R.T., Nguyen T.T., Duffy K.E., Wittrock R.J., Leary J.J. Antimicrob. Agents Chemother. - 2000. - V.44, № 6.– P. 1524-1529]

П.Г. Дерябин, Г.А. Галегов ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России, директор Института академик РАН Д.К. Львов