Конкурс молодих учених. 1 місце.

Загальновизнано, що в патогенезі захворювань надниркових залоз значну роль відіграє взаємодія генетичних чинників та вплив оточення. Найчастіше відзначають доброякісні новоутворення надниркових залоз людини, серед яких переважають аденоми. Злоякісні пухлини виявляють значно рідше: щорічно діагностують 0,5-2 випадки на 1 млн населення. 
Адренокортикотропний гормон гіпофізу (АКТГ, кортикотропін) є головним регулятором адренокортикальної функції, який забезпечує диференціювання, проліферацію адренокортикоцитів, а також їх генетично запрограмовану загибель шляхом апоптозу. Кортикотропін викликає надзвичайно швидку активацію секреції кортикостероїдів, але деякі дослідники не змогли встановити гіпертрофію залоз при введенні гормону. Несприятливі чинники середовища і розвиток стресу підвищують секрецію гормонів, змінюють гормональний баланс і викликають гіпертрофію надниркових залоз. Аналіз сигнальних шляхів клітин, що опосередковують функціональні та трофічні впливи на залозу, заслуговує уваги, а також має важливе практичне значення.
Серед рецепторів, що сприймають сигнали первинних месенджерів у надниркових залозах, рецептор АКТГ є найбільш дослідженим. Різну чутливість кори надниркових залоз до АКТГ забезпечують регуляторні фактори, до яких належить сам кортикотропін, інсуліноподібний фактор росту IGF-1, фактор росту пухлин TGFβ та ін. Рецептори АКТГ ідентифіковані також в адипоцитах, меланоцитах, лімфоцитах та ЦНС. 
Оскільки активація рецепторів АКТГ призводить до продукції сАМР, він належить до групи рецепторів, зв'язаних з G-білками, та має гомологію нуклеотидної послідовності з представниками цього великого сімейства генів. За цим критерієм ген рецептора АКТГ клонований з меланоми людини, яка характеризується високим ступенем зв'язування меланокортину. Клон, що містив ген рецептора АКТГ, ідентифікований зокрема за функціональною експресією: при його трансфекції в клітини, які не реагують на АКТГ, відбувалася продукція сАМР у відповідь на кортикотропін (2 нМ). Суттєвий прогрес у розумінні експресії рецептора АКТГ відбувся після клонування гена рецептора групою Cone у 1992 році.
Дослідження нуклеотидної послідовності та екстрапольованої амінокислотної послідовності дало змогу з'ясувати гомологію рецептора АКТГ з іншими рецепторами, з'єднаними з G-білками, і зарахувати цей рецептор, що складається з 7 трансмембранних доменів, до сімейства рецепторів меланокортину (МС2R). На відміну від інших меланокортинових рецепторів, що здатні зв'язувати як кортикотропін, так і меланоцитстимулювальний гормон, МС2R-рецептори здатні зв'язувати тільки АКТГ. Більшою мірою експресія МС2R відзначається в клубочковій і пучковій зонах кори надниркових залоз, менше – в сітчастій зоні. Для рецепторів МС2R характерна коротка NН2-термінальна позаклітинна ділянка, коротка СООН-термінальна внутрішньоклітинна ділянка та 7 трансмембранних доменів. Рецептор АКТГ виявився найкоротшим із всієї групи – 297 амінокислотних залишків з молекулярною масою 33 кДа. Глікозилювання за двома сайтами, що містяться на NН₂-термінальній частині рецептора, може збільшувати його молекулярну масу до 43 кДа.
Точкові мутації в рецепторі АКТГ спричиняють зникнення відповіді на агоніст. Заміна залишку серину у 74 положенні на ізолейцин проходить при розвитку сімейної недостатності надниркових залоз і проявляється нечутливістю рецептора до АКТГ. Наслідком такої точкової мутації є високий рівень АКТГ, низький рівень кортизолу і гіперпігментація. Дослідження локалізації й експресії мРНК-рецептора АКТГ в нормальній тканині і пухлинах надниркових залоз людини довели, що в доброякісних новоутвореннях надниркових залоз між експресією мРНК-рецептора і цитохрому Р450_scc, найважливішого ферменту стероїдогенезу, зафіксована чітка кореляція. В карциномах надниркових залоз такої кореляції не спостерігалось.
Участь циклічного АМФ у реалізації ефекту АКТГ виявлено невдовзі після відкриття сАМР. Показано, що кортикотропін активує аденілатциклозу (АЦ) і підвищує рівень сАМР тканини. 
У більшості типів клітин продукція та акумуляція сАМР регулюється балансом між активацією АЦ через G_s-білок та пригніченням через G_i-інгібіторний білок. На сьогодні клоновано 9 ізоформ АЦ, об'єднаних у 4 класи. Важко пояснити, чим визначається така велика кількість ізоформ АЦ та їх роль у подальшому синтезі сАМР. Можна припустити, що різні ізоформи АЦ можуть брати участь у перенесенні сигналів різних агоністів і модуляторів функції залози. Очевидно, наявність ізоформ АЦ з різною чутливістю до іонів Са²⁺ і різною локалізацією дозволяє впливати на перерозподіл шляхів месенджерних каскадів різних агоністів.
Концентрація сАМР в клітині визначається балансом між ізоформами АЦ, що синтезують сАМР, і фосфодіестеразами, що розщеплюють 3'-фосфодіефірний зв'язок циклічних монофосфатів. АКТГ (10 нМ) індукує 28-разове підвищення рівня сАМР в клітинах клубочкової зони кори надниркових залоз. Попередня інкубація цих клітин з інгібітором фосфодіестераз ізобутилметилксантином збільшує продукцію сАМР на 100%. Тобто, АКТГ знижує активність цГМФ-залежної фосфодіестерази-2, яка вважається основною формою фосфодіестераз в корі надниркових залоз.
Регуляція кортикотропіном адренокортикальної функції забезпечується здебільшого за рахунок прямого фосфорилювання сАМР-залежною протеїнкіназою А (ПКА) специфічних білків, а також стероїдогенних факторів SF-1 та SF-2, що беруть участь у регулюванні стероїдогенезу, змінюючи його швидкість.
Одним з найважливіших субстратів протеїнкіназ в усіх стероїдогенних тканинах є білок-регулятор гострої фази стероїдогенезу – StAR. Процеси регулювання кортикотропіном експресії StAR є як сАМР-, так і протеїнкіназа С (ПКС)-залежними. StAR відіграє значну роль у регулюванні транспорту холестерину з зовнішніх до внутрішніх мітохондріальних мембран, де за допомогою цитохрому Р450_scc здійснюється реакція, що лімітує швидкість стероїдогенезу. У відповідь на стимуляцію тропними гормонами в цитозолі синтезується білок-попередник з молекулярною масою 37 кДa, сигнальна ділянка якого взаємодіє з рецепторами мітохондрій.
Останнім часом одержані чіткі дані про те, що дія АКТГ опосередковується не тільки сАМР і ПКА0, кортикотропін запускає розгалужену систему трансдукції сигналу, окремі компоненти якої взаємодіють на різних етапах. Він здатен активувати інші протеїнкінази, особливу увагу дослідників привернула ПКС і протеїнкінази, що активуються мітогенами (МАР-кінази). Під впливом АКТГ in vitro у мікросомальній фракції адренокортикоцитів вірогідно підвищується загальна активність ПКС на фоні збільшення продукції 11-гідроксикортикостероїдів тканиною надниркових залоз. Методом вестерн-блотингу визначена транслокація α-ізоформи ПКС до ядерної фракції після передінкубації тканини кори надниркових залоз з різними концентраціями кортикотропіну (рис. 1 ). 
АКТГ викликає швидку активацію МАР-кіназ, позаклітинно-регулюючих кіназ (Extracellular-Regulated Kinase) 1/2 (ERK1/2) і JNK в клітинах Y1, отриманих із пухлини надниркових залоз мишей.
Ядерний етап перенесення сигналу АКТГ полягає в активації факторів транскрипції та регулювання експресії специфічних генів стероїдних гідроксилаз. Продукти протоонкогенів c-jun та c-fos, білки jun і fos, утворюючи гомо- та гетеродимерні комплекси, входять до складу фактора транскрипції АР-1 – надзвичайно важливого елемента трансдукції і ампліфікації сигналу кортикотропіну в ядрі. Короткотривалий вплив АКТГ викликає зростання вмісту білка c-fos в клітинах Y1. При тривалому введенні АКТГ мРНК c-fos знижується до контрольного рівня.
Все це дуже ускладнює перенесення сигналу кортикотропіну, оскільки встановлено, що експресія факторів транскрипції і специфічних генів опосередковується, з одного боку, сАМР-залежною ПКА, з іншого – ПКС. Можлива також трансрегуляція з боку месенджерного каскаду, до якого залучені МАР-кінази.
За нашими даними, через 1 год після введення щурам АКТГ вміст ERK1/2 в адренокортикальній тканині зростає більш ніж на 50%, а через 6 год починає знижуватись (рис. 2). Вважається, що проліферативна дія АКТГ реалізується в клітинах кори надниркових залоз за рахунок активації ERK 1/2-кіназ (р42/44), які належать до родини серин-треонінових протеїнкіназ, що активуються мітогенами. До сімейства МАР-кіназ відносять також JNK (c-Jun NH₂-термінальна кіназа або стрес-активована протеїнкіназа) та р38-кіназу. Ці серин-треонінові кінази у свою чергу є активаторами факторів транскрипції, що індукують експресію відповідних генів. За одними даними, АКТГ не виявляв стимулювальної дії на МАР-кіназну активність та блокував ефекти фактора росту фібробластів (FGF2) на стимуляцію ERK1/2. Проте інші дослідження на клітинах Y1, отриманих з адренокарцином мишей, довели, що АКТГ здатен індукувати швидке зростання активності ERK1/2 та стимулювати входження клітин у S-фазу клітинного циклу.
Найбільш виражений вплив чинить АКТГ на рівень JNK-кінази. Через 1 год після введення її вміст зростає більш ніж удвічі, через 6 год достовірно знижується (рис. 2). За даними літератури, АКТГ як in vitro в клітинах Y1, так і in vivo у 3-4 рази стимулював активність залежних від ПКС кіназ, що активуються мітогенами, а саме JNK. Форболові ефіри також індукували підвищення активності JNK в Y1-клітинах. Під впливом сАМР такий ефект не спостерігався. Протеїнкіназні інгібітори Н-89 і Н-8 блокували стимульовану АКТГ активність JNK. Кальцієвий іонофор А23187 підвищував індуковану кортикотропіном активність JNK втричі, а хелатор іонів Са²⁺ ЕДТА істотно її знижував. Можна зробити висновок, що АКТГ індукує активність JNK через Са²⁺-залежний месенджерний шлях, що залучає ПКС. Пригнічення активності ERK може пояснити антипроліферативний ефект АКТГ і зменшення синтезу ДНК, а стимуляція активності JNK має кореляцію з гіпертрофією адренокортикальних клітин. 
Заслуговує уваги участь фактора транскрипції АР-1, що складається з двох транскрипційних факторів с-jun і с-fos – в перенесенні сигналу АКТГ. Відомо, що продукти генів ранньої відповіді (early genes) c-myc, c-jun, c-fos, jun В і fos B, яких ще інколи називають третинними месенджерами різних факторів, що контролюють проліферацію і диференціювання різних типів клітин, зокрема беруть участь в регуляції структурних і функціональних характеристик адренокортикоцитів. Рівень с-jun в корі надниркових залоз зростає майже вдвічі через 1 год після введення АКТГ. Привертає увагу значне збільшення з часом рівня с-fos, який достовірно зростає в 1,7 разу тільки через 6 год після введення кортикотропіну (рис. 2). Індукція c-fos та стимуляція синтезу ДНК під дією АКТГ істотно гальмується інгібітором кінази МЕК1 PD98059. 90% інгібування c-fos мРНК блокує стимульований АКТГ перехід клітин Y1 до S-фази клітинного циклу.
Виявилося, що c-jun та c-fos не єдині протоонкогени, експресія яких стимулюється АКТГ. Зокрема показано, що АКТГ істотно підсилює експресію протоонкогена c-myc в культивованих клітинах надниркових залоз людини H295R та мишей Y1. сАМР і форболові ефіри також підсилювали експресію c-myc. Експерименти інгібіторами ПКА і ПКС дали змогу встановити, що обидва протеїнкіназних механізми можуть бути залучені до модулювання експресії c-myc.
Короткий термін дії АКТГ стимулює мітотичний цикл в S-фазі і активацію МАР-кінази. Цей ефект не потребує сАМР, оскільки відтворюється в мутантних клітинах, що не експресують ПКА. Однак сАМР-залежне гальмування проліферації спостерігається при тривалій наявності АКТГ в середовищі культивування клітин Y1. Отже, пригнічення проліферації кортикотропіном може опосередковуватись сАМР, а стимулюючий ефект – МАР-кіназами. Отримані нами результати дозволяють зробити висновок, що важлива роль у трансдукції сигналу АКТГ в адренокортикоцитах належить МАР-кіназі JNK і фактору транскрипції с-jun.
Без сумніву, вплив АКТГ на адренокортикоцити здійснюється головним чином через месенджерну систему сАМР-залежної ПКА. Проте нові дані щодо опосередкування дії кортикотропіну через активацію фосфоліпаз, утворення інозитолфосфатів та діацилгліцерину дозволяють переоцінити роль Са²⁺ та сигнальних ланцюгів, пов'язаних з ПКС і МАР-кіназами, у трансформації регуляторного сигналу кортикотропіну в клітинах.
Існує припущення, що сАМР-залежний шлях перенесення сигналу може водночас зумовлювати інгібування росту адренокортикальної пухлини, а інактивація рецепторів АКТГ – спровокувати формування пухлини. Під впливом фізіологічних доз АКТГ зменшуються розміри МС2R-позитивних пухлин надниркових залоз на відміну від МС2R-негативних.
Активація ПКА призводить до інгібування проліферації клітин адренокортикальних карцином людини лінії H295R, а також до збільшення апоптотичних ефектів, спричинених впливом фактора некрозу пухлин-a. На інших клітинних лініях аденокарцином – SW-13 (людини) та Y-1 (мишей) – такі ефекти не спостерігаються. В короткочасних експериментах з культурою адренокортикоцитів щурів показано, що АКТГ пригнічує їх ріст.
Відомо, що АКТГ викликає транслокацію ПКС з цитозолю до мембран та її активацію. Проте роль ПКС в регулюванні адренокортикальної функції й процесах апоптозу вивчена недостатньо. Більшість дослідників підкреслюють антиапоптотичну дію ПКС: активація ферменту призводить до активації білка-інгібітора апоптозу ХІАР і фосфорилювання антиапоптотичного білка Bcl-2. У клітинах раку щитовидної залози антиапоптотичні ефекти опосередковуються ПКС- і сАМР-залежними системами шляхом пригнічення індукованого церамідом апоптозу. Проте, за іншими даними, активація ПКС форболовими ефірами розпочинає процеси апоптозу у різних типах клітин. У Т-лімфоцитах інгібування ПКС змінює експресію антиапоптотичних білків та активує каспази (цистеїнові протеази СРР32), що є основними ферментами апоптозу.
Для оцінки апоптотичних змін у тканині кори надниркових залоз ми обрали два підходи: визначення вмісту каспази-3 методом імуноблотингу та характеристика фрагментації ДНК, яка є свідченням переходу клітини до завершальних етапів апоптозу. Утворення характерної для апоптозу чіткої «драбинки» здійснюється ендонуклеазами, які розщеплюють ДНК хроматину на відрізки фіксованого розміру. На відміну від апоптозу некроз характеризується деградацією ДНК з утворенням головним чином низькомолекулярних фрагментів різної довжини.
Унесення до середовища інкубації АКТГ викликає достовірні зміни вмісту каспази-3 в адренокортикоцитах. Рівень каспази-3 в присутності кортикотропіну знижується як в абсолютних величинах (в 1,7 разу), так і у відсотках по відношенню до контролю (на 40%). Хелеретрину хлорид (ХХ), здатний пригнічувати активність ПКС, справляє протилежну дію: уміст каспази-3 збільшується на 22%. При одночасному додаванні АКТГ і ХХ спостерігається ефект, більш характерний для ХХ.
Подібна ситуація відзначається при дослідженні фрагментації ДНК (рис. 3). Під впливом АКТГ достовірно знижується рівень фрагментації ДНК на 13%. Тенденція до збільшення фрагментації ДНК спостерігається як при додаванні до середовища інкубації інгібітора ПКС ХХ, так і його комбінації з кортикотропіном. 
Отримане під впливом АКТГ зниження рівня каспази-3 та фрагментації ДНК можна пояснити саме активацією ПКС, оскільки нами було показано підвищення активності цього ферменту в мікросомальній фракції адренокортикоцитів людини внаслідок дії кортикотропіну. 
На культурі клітин лінії SQ-20B (карцинома голови та шиї людини) показано, що використання ХХ, який має здатність інгібувати активність ПКС, in vitro спричиняло зменшення кількості клітин, що виживали, підвищувало сфінгомієліназну активність, викликало конденсацію хроматину і ядер. Це може пояснюватись як індукцією апоптотичних процесів у цих клітинах, так і прямою дією ХХ на ДНК.
ПКС є важливим компонентом ще майже не визначеного механізму ростових ефектів кортикотропіну. В короткочасних експериментах з культурою адренокортикальних клітин щурів та мишей АКТГ або не впливає на їх ріст, або пригнічує його. При культивуванні протягом 72 год і більше АКТГ здатен стимулювати проліферацію адренокортикоцитів.
АКТГ in vivo помітно впливає на апоптотичні процеси в корі надниркових залоз. Посилення апоптозу у щурів відзначали вже через 12-24 год після гіпофізектомії. При культивуванні надниркових залоз іn vitro за умов відсутності АКТГ апоптоз починався значно швидше, ніж після гіпофізектомії, і був набагато інтенсивнішим. Унесення кортикотропіну до середовища інкубації знижувало фрагментацію ДНК на 44%, але гальмування процесів апоптозу до контрольного рівня досягти не вдавалося. Відомо, що АКТГ чинить захисну дію у зв'язку з індукованою дексаметазоном атрофією кори надниркових залоз. У мишей, які отримували кортикотропін на фоні дексаметазону, повністю зникали апоптотичні адренокортикальні клітини.
Швидкість апоптотичних процесів у пухлинних клітинах порівняно з такими в нормальних може значно відрізнятися. Клітини пухлин, зокрема адренокортикальних, значною мірою захищені від апоптозу внаслідок змін експресії генів, які кодують білки, залучені до сигнальних шляхів клітини антиапоптотичного спрямування. У карциномах виявлено значні мутації генів TP53, RAS.
Отримані нами результати свідчать про те, що кортикотропін справляє помітну антиапоптотичну дію на кору надниркових залоз людини. Виявлені під впливом АКТГ антиапоптотичні зміни в клітинах надниркових залоз, що оцінюються за вмістом каспази-3 і ступенем фрагментації ДНК, значною мірою визначаються активацією ПКС. 
Нині інтенсивно ведуться дослідження з метою виявлення можливості залучення як протипухлинних засобів препаратів, що діють саме на рівні сигнальних шляхів, причетних до трансформації клітин. Інгібування ПКС, зокрема ХХ, може стати допоміжним заходом для посилення апоптотичної загибелі клітин під впливом канцеростатичних препаратів або іонізуючої радіації. Крім ПКС-залежного впливу ХХ, що може викликати апоптоз, ймовірною є його пряма дія на ДНК. Отже, посилення фрагментації ДНК під впливом ХХ може пояснюватись його цитотоксичною дією, високим ступенем спорідненості до ДНК та здатністю цього алкалоїда до інтеркаляції. Конформація молекул ХХ зумовлює його енергетично вигідне розміщення між парами азотистих основ у спіралі ДНК, що забезпечує стабілізацію спіралі (підвищення температури плавлення) ДНК і, як наслідок, гальмування процесів реплікації.
Отримані факти можуть бути використані під час розробки нових патогенетичних підходів до корекції трофічних та функціональних процесів у надниркових залозах при широкому спектрі захворювань. Зараз до кола протипухлинних засобів залучають препарати, що можуть діяти на рівні месенджерних систем, зокрема пов'язаних із шляхом ПКС. Відхилення саме в цій ланці сигнального каскаду часто є причиною пухлинних трансформацій клітин, саме вона є мішенню низки потенційних протипухлинних препаратів, до яких може бути віднесений і ХХ. Таким чином, окреслюються нові перспективи пошуку засобів для лікування новоутворень надниркових залоз.
Спираючись на експериментальні та літературні дані, можна стверджувати, що вплив кортикотропіну на функцію кори надниркових залоз значно складніший, ніж вважалося досі (рис. 4). Ефекти АКТГ здебільшого пов'язані з регуляцією стероїдогенезу в адренокортикальній тканині. Однак отримані нами дані щодо впливу кортикотропіну на зміни рівня каспази-3 та фрагментації ДНК дозволяють вважати його одним із факторів, що регулюють також апоптотичні процеси в адренокортикоцитах.

Комментарии к статье